Vyšetření funkce fagocytů Mgr. Julie Štíchová Bioanalytik jarní semestr 2021 Výkonné buňky nespecifické imunity Profesionální fagocyty  Neutrofilní granulocyty  Tvoří 50 – 70 % z WBC  Nízká fagocytární aktivita – „mikrofágy“  Krátká životnost  Monocyty  2-12 % z WBC  Z cirkulace přecházejí do tkání kde diferencují v makrofágy  Dlouhá životnost  Vyšší fagocytární kapacita První obranná linie  Poranění tkání – reflexní spasmus malých cév  zábrana krvácení  aktivace koagulace, komplementu  Poranění tkání  aktivace tkáňových makrofágů  Produkce prozánětlivých cytokinů (IL-6, IL-1β) a chemokinů (IL-8)  Rozvoj zánětu, lákání neutrofilů do místa infekce Průnik do místa infekce 1. ADHEZE  Endotelie – vlivem prozánětlivých cytokinů exprese adhezivních molekul  E a P selektiny - reverzibilní vazba – rolling Průnik do místa infekce 2. Extravazace  Pokud při rollingu přetrvává zánětlivý signál, následuje ireverzibilní vazba na endoteliální stěnu – LFA na povrchu neutrofilu se váží na endoteliální integriny – VCAM, ICAM  ireverzibilní vazba na endotel 3. Diapedéza  Prostup skrze endotelie  PECAM, JAM, CD99  Transcelulární  Paracelulární Průnik do místa infekce 4. Chemotaxe  V místě zánětu tvořeny látky s chemotaktickými účinky  Exogenní – fMLP  Endogenní – C3a, C5a, IL-8, CXCL8, CXCL-7  Vazba na receptory neutrofilního granulocytu  Pohyb ve směru koncentračního gradientu  Produkce hydrolytických enzymů  narušení mezibuněčné hmoty  prostup do místa zánětu pomocí reverzibilních interakcí adhezivních molekul Rozpoznání patogenní částice  Pattern recognition receptors (PRR)- rozpoznávají PAMPs (103 struktur)  TLR, NOD-like, NLR, RIG-like receptory  Vazba patogenní částice na receptory zahájí vlastní proces fagocytózy:  Ingesce – fagosom  Digesce -splynutí fagosomu s lysozomy – konečná degradace  Mechanismy zabíjení na kyslíku nezávislé  Mechanismy zabíjení na kyslíku závislé Mechanismy zabíjení na O2 nezávislé  Antimikrobiální peptidy a enzymy  Kathepsiny  Lysozym  Defenziny  Kyselé pH  Proteiny omezující dostupnost stopových prvků a vitaminů  Laktoferin – vyvazuje železo  Vitamin B12 binding protein Mechanismy zabíjení na O2 závislé  Enzymatická tvorba reaktivních kyslíkových mediátorů  Doprovázená výraznou spotřebou kyslíku – oxidační vzplanutí  Ústřední role – NADP oxidáza NADPH oxidáza  Intracelulární lokalizace - membrány  6 podjednotek (2 v membráně fagolysosomů, 4 v cytosolu)  Aktivace – signální kaskáda spuštěná receptory – fosforylace podjednotek NADPH oxidáza Myeloperoxidáza  Oxidoreduktáza  Obsahuje hemovou skupinu – nazelenalé zbarvení  Přeměna peroxidu vodíku na kyselinu chlornou, která je až 50 krát účinnější  Kyselina chlorná může být substrátem dalších reakcí, při kterých vzniká hydroxylový radikál a signletový kyslík – lipoperoxidace membrán  smrt fagocytující buňky iNOS inducibilní syntáza oxidu dusnatého  Azurofilní granula neutrofilů, monocytů  Tvorba NO z aminokyseliny argininu – podíl na degradaci patogenů  Regulace MPO – Tvorba NO redukuje aktivitu MPO Závěrečná fáze fagocytózy  Vyloučení degradovaných částí patogenů exocytózou  Neutrofily brzy podléhají poškození a umírají  Ve tkáních jsou fagocytovány makrofágy  Nahromadění zbytků mikroorganismů a fagocytů – hnis (nazelenalé zbarvení způsobuje MPO) Fagocytózou to někdy nekončí  Jak se fagocyty podílejí na eliminaci patogenů, které nemohou být díky své velikosti nebo agresivitě zfagocytovány? Pseudomycelia Candida albicans Staphylococcus aureus NETóza  Nový typ buněčné smrti  Reaktivní kyslíkové mediátory tvořené NADPH oxidázou jsou druhými posly  Dochází k citrulinaci histonů, rozvolnění jaderného chromatinu a jeho vypuzení do extracelulárního prostoru NETóza  Vzniká síť tvořená jaderným materiálem, obsahující MPO a některé další antibakteriální peptidy z granulí neutrofilů  Do procesu NETózy vstupuje pouze malá část aktivovaných neutrofilů  Účel –většinou boj s velkými patogeny, které nemohou být zfagocytovány  MPO, cadheliciny, defenziny – mikrobicidie  Síť – omezení šíření patogenů v prostoru  Možné nežádoucí důsledky  Uvolnění intracelulárních komponent – možná tvorba autoprotilátek proti intracelulárním strukturám neutrofilů  Podezření z účasti na imunitně podmíněné trombóze Vyšetření fagocytózy  Adheze  Deficit adhezivních molekul integrinů (CD11b/CD18), které jsou nezbytné pro adhezi fagocytů na endotelie  Deficit CD11b/CD18 způsobuje imunodeficit zvaný jako LAD syndrom (leukocyte adhesion decifiency)  Projevy – z důvodu neschopnosti fagocytů přestoupit skrze endoteliální výstelku  zvýšená náchylnost k infekcím, tvorba zánětlivých ložisek s minimem hnisu, výrazná akumulace fagocytů v periferní krvi, nedostatek v místě zánětu  Laboratorní detekce – stanovení exprese CD11b/CD18 na povrchu fagocytů  u LAD syndromu deficit CD11b/CD18 Vyšetření fagocytózy  Chemotaxe  Boydenova komůrka  migrace fagocytů v nádobce skrze membránu s velmi malými pózy ve směru chemotaktického gradientu  Počítání buněk které pronikly na druhou stranu membrány  Migrace pod agarózou  Do agarózového gelu se vyříznou jamky – do jedné se pipetuje suspenze vyšetřovaných buněk, do druhé chemoatraktant  Buňky migrují směrem k jamce s chemoatraktantem  Po inkubaci 4 h se gel usuší a obarví  Odečítá se vzdálenost, kterou buňky urazily od středu jamky Vyšetření fagocytózy  Test ingesce  Testuje se schopnost buněk pohltit mikrosferické hydrofilní partikule (MSHP)  Krev se inkubuje s MSHP částicemi  Poté se zhotoví nátěr krve a obarví se  Počítají se 100 buněk, pozitivní jsou ty, co obsahují v cytoplazmě 3 a více MSHP částic  Význam má snížení – sepse, nádory, nezralé formy granulocytů Vyšetření oxidačního vzplanutí  INT/NBT test  Inkubace krve s nitroblue tetrazolium chloridem (NBT) nebo jod nitroblue tetrazolium chloridem (INT) a látkou stimulující oxidační vzplanutí  Při oxidačním vzplanutí dochází k redukci NBT nebo INT na nerozpustný barevný formazan  Hodnocení počtu pozitivních buněk (obsahují barevná granula)  Chemiluminiscence  Stimulace buněk (PMA, fMLP, bakterie, zymosan)  Přídavek chemiluminiscenční látky – vlivem oxidačního vzplanutí dochází k oxidaci chemiluminiscenční sondy*  emise fotonů  přístroj luminometr počítání záblesků  Vzhledem k výsledku (počty záblesků) je nutno znát absolutní počet granulocytů u pacienta  výsledky se musí přepočítat na počet buněk v reakci!  *Luminol, isoluminol Burst test (BTT)  Detekce oxidačního vzplanutí v granulocytech a monocytech pomocí průtokové cytometrie  Princip – Produkty oxidačního vzplanutí oxidují fluorescenční barvivo  Funkční test  Odběr krve do heparinu  Nejsou stanoveny konkrétní referenční meze  Nutno se vzorkem pacienta vždy zpracovat i vzorek zdravé kontroly!  Hodnocení – porovnání pacienta s kontrolní osobou – % pozitivních granulocytů a monocytů Burst test (BTT) Oxidační vzplanutí může být indukováno různými způsoby Opsonizace E.Coli protilátkami  vazba na Fc receptory Chemoatraktant fMLP – vazba na formylpeptidové receptory spřažené s malými G proteiny – indukce chemotaxe a také slabé aktivace NADPH oxidázy PMA – nízkomolekulární látka, přímo proniká membránou a váže se na proteinkinázu C  rychlá a masivní aktivace Fc receptor Formylpeptidový receptor fMLP PKC AKTIVACE Burst test (BTT)  Krok 1: Stimulace fagocytů  PBS – negativní kontrola  E. Coli – vazba na Fc receptory – aktivace fosfatidylinositol 3-kinázy (PI3K) pozn. v reakci je nutná přítomnost opsonizujích protilátek – bez nich granulocyty na E.coli nereagují (např. izolované granulocyty z krve) orientační norma > 70 %  PMA – malá molekula – rychlý průnik skrze membránu do cytoplazmy – přímá vazba na proteinkinázu C (PKC) – rychlá a masivní aktivace, která po krátké době může vést i ke smrti buňky orientační norma > 90 %  Proč různé stimulace?  široké spektrum patogenů, různé cesty aktivace NADPH oxidázy  Snaha postihnout nejčastější signální dráhy aktivace, které vedou k fosforylaci NADPH oxidázy a její aktivaci  může být defektní pouze určitá dráha aktivace Burst test (BTT)  Krok 2: Zviditelnění produkce ROS pro průtokový cytometr  Fluorescenční barvivo Dihydrorhodamin 123 (DRH 123)  vlivem ROS dochází k oxidaci na Rhodamin 123  Fluorescence při 536 nm (zelená)  Světelná emise zaznamenána detektory cytometru  Intenzita fluorescence úměrná aktivitě oxidačního vzplanutí Burst test (BTT) – hodnocení Intenzita fluorescence Chronická granulomatózní choroba (GCD)  Defekt NADPH oxidázy – porucha tvorby ROS  Dědičnost X- vázaná (závažnější) nebo autosomálně recesivní (mírnější)  1:250 000  Náchylnost k infekcím kataláza pozitivními patogeny a mikromycetami (plísně)  Tvorba hlubokých abscesů (mohou působit útlak okolních tkání)  Časný nástup choroby GCD de-novo mutace – autosom. recesivní Matka i otec mají neporušenou aktivitu oxidačního vzplanutí fagocytů, zatímco jejich dítě (pacientka) po PMA vypadá shodně s negativní kontrolou GCD X-vázaná Pacient po stimulaci PMA nereaguje (shodný obraz s negativní kontrolou) Otec má oxidační vzplanutí po PMA v normě (1 pík vpravo) Ale matka má dvojí populaci neutrofilů – jedna populace (pík vpravo) reaguje na stimulaci, ale druhá populace (pík vlevo) nereaguje  matka je přenašečkou mutace Myeloperoxidáza (MPO, MXX)  Oxidoreduktáza  Obsažena v granulích neutrofilů a monocytů  Obsahuje hem – nazelenalé zbarvení sekretů s vyšším obsahem fagocytů  Přeměňuje peroxid vodíku na kyselinu chlornou (až 50 krát toxičtější)  NETóza - MPO obsažena v síti tvořené jaderným materiálem  Negativní regulace pomocí syntézy NO – tvorba nitrosylových komplexů Deficience myeloperoxidázy  Deficience vrozená: 1. částečná - výskyt cca 1:2000 2. úplná - výskyt cca 1:4000  Dědičnost - autosomálně recesivní  Až 50% pacientů klinicky asymptomatických  Závažný průběh nemoci – 5-10% postižených (časté infekce, zejména plísně)  Deficience získaná:  diabetes mellitus, těžké infekce, nedostatek železa, intoxikace olovem, diseminované tumory, některé leukemie MPO – příprava vzorku  1 pacient – 2 zkumavky  Značení buněk pomocí anti-CD14 (vyčlení granulocyty, monocyty)  Promytí  Fixace, permeabilizace membrán (MPO je intracelulární)  Pouze jedna zkumavka -značení protilátkou anti-MPO  Druhá zkumavka se neznačí – slouží jako izotopová kontrola  Hodnocení - % MPO pozitivních granulocytů a monocytů  Norma 75 -100% ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO Exprese MPO - granulocyty pacientka zdravá kontrola89% ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO Burst test - stimulace E. coli Počet aktivovaných buněk: 95% Stimulační index: 163 Počet aktivovaných buněk: 89% Stimulační index: 22 pacientka zdravá kontrola ZDRAVÁ KONTROLA PACIENTKA SROVNÁNÍ Deficit MPO Burst test - stimulace PMA Počet aktivovaných buněk: 97% Stimulační index: 281 Počet aktivovaných buněk: 92% a 6% Stimulační index: 23 a 201 pacientka zdravá kontrola