Katedra laboratorních metod Laboratorní diagnostika ve
LF MU zdravotnictví
Klinická biochemie cvičení
- 1 Praktické
cvičení č. datum________________ jméno__________________
Téma praktika:
Stanovení katalytické aktivity enzymů, kinetické měření.
Okruhy k nastudování a dotazy:
1) Seznamte se s postupem uvedeným v protokolu.
2) Při jakých teplotách se v současnosti v klinické biochemii enzymatické měření
provádí?
3) Do protokolu načrtněte graf závislosti absorbance na koncentraci pro laktát
dehydrogenázu (LD) stanovovanou uvedeným principem (malý obrázek).
4) Na automatickém analyzátoru budete stanovovat také alaninaminotransferázu (ALT) –
seznamte se s běžně užívaným principem stanovení a dle toho načrtněte graf závislosti
absorbance na koncentraci (při vlnové délce 340 nm).
Přístroje a pomůcky:
Manuální fotometr
Automatický biochemický analyzátor
Reagenční set LDH - IFCC (Roche)
Úkoly:
1) Provést manuální stanovení LD dle následujícího návodu
Princip:
L-laktát + NAD+
<____LD____
> pyruvát + NADH + H+
Katalytická aktivita LD je úměrná nárůstu absorbance při 340 nm.
Složení setu :
Činidlo1: N-metylglukamin, laktát litný, stabilizátory
Činidlo 2: NAD+
Referenční interval: 2,25 — 3,75 ukat/l M
2,25 — 3,55 ukat/l Ž
Katedra laboratorních metod Laboratorní diagnostika ve
LF MU zdravotnictví
Klinická biochemie cvičení
- 2 Příprava
pracovního roztoku :
Používá se přímo
Pracovní postup:
odměřit v ml vzorek kalibrátor
činidlo 1
sérum
kalibrátor
1.00
0.030
-
1.00
-
0.030
promíchat, inkubace 5 minut při 37°C, na tento roztok spektrofotometr vynulovat
činidlo 2 (vytemperované na
37°C)
0.200 0.200
promíchat,
nalít do kyvety, měřit absorbance ve stanovených časových intervalech
a) Změřte katalytickou aktivitu LD pro kalibrátor, a dva vzorky. Proveďte časové
měření po 60s v časovém intervalu 4 minut (horní rozsah A nastavte3,0, čas
270s, interval měření A 10s)
Kal. A A Vz.1 A A Vz.2 A A
měření po smíchání
měření za 1 minutu
měření za 2 minutu
měření za 3 minutu
měření za 4 minuty
Katedra laboratorních metod Laboratorní diagnostika ve
LF MU zdravotnictví
Klinická biochemie cvičení
- 3 b)
Z naměřených dat vypočtěte katalytickou aktivitu LD v neznámých vzorcích
c) Hodnoty pro kalibrátor zpracujte graficky na milimetrový papír jako závislost
absorbance na čase
2) Na automatickém biochemickém analyzátoru změřit katalytickou aktivitu ALT,
AST, CK a LD u tří připravených vzorků (jedná se o vzorky s vysokými
hodnotami):
a) Důkladně se seznamte s grafickým zpracováním průběhu reakce (vyčerpání
substrátu) a vyznačením rozmezí bodů, ve kterých probíhá měření
b) Dle potřeby proveďte rerun vzorků – různé možnosti automatického ředění
(snížení pipetovaného objemu vzorku), které provádí analyzátor a také ruční
ředění. Výsledky včetně násobku ředění a chybových hlášení zapište do
tabulky:
Závěr:__________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Č.vzorku/ukat/l ALT AST
1. měření Rerun Ručně řed. Přepoč. 1. měření Rerun Ručně
řed.
Přepoč.
1
2
3
Č.vzorku/ukat/l CK LD
1. měření Rerun Ručně řed. Přepoč. 1. měření Rerun Ručně
řed.
Přepoč.
1
2
3