datum___________ jméno__________________ Téma praktika: Praktické cvičení radioimunoanalýza - stanovení 17-OH-progesteronu 1. Nastavení metody na gamaměřiči LB 2111 Nadefinování metody, typu kalibrace, zadání cílových hodnot kalibrátorů, nastavení kontrol. Seznámení s přístrojem - princip, validace přístroje. 2. Vlastní provedení stanovení 17- hydroxyprogesteronu v pacientských vzorcích Okruhy k nastudování a dotazy: 1. Jaká značenka se v RIA používá nejčastěji? 2. Co je to ionizující záření? 3. Jaká jsou specifika pro g-záření (jakých je energií, jaké vlnové délky, propustnost)? 4. Co se děje při „fotoefektu“ a při „Comptonově rozptylu“? Přístroje a pomůcky: Gamaměřič LB 2111 multidetektorový gama měřič pro radioimunoanalýzu Souprava na stanovení 17-hydroxyprogesteronu (Immunotech) Vzorky sér Teorie, princip stanovení Stanovení 17 –hydroxyprogesteronu v séru nebo plazmě (heparin, EDTA) soupravou RIA (dodává Immunotech). Principem stanovení je kompetitivní radioimunoanalýza. Standardy, kontrolní vzorky a vzorky se inkubují ve zkumavkách potažených monoklonální protilátkou společně s radioindikátorem ^125 I značených 17-OH-progesteron. Po inkubaci se odsaje obsah zkumavek a změří se vázaná radioaktivita. Naměřená radioaktivita nepřímo úměrná koncentraci analytu. Princip scintilačního detektoru g-counter Berthold (LB 2111) slouží ke kvantitativnímu měření radioaktivity g-záření (vyjádřeno v jednotkách cpm). g-counter Berthold je vybaven scintilačním detektorem, který je založen na vzniku luminiscence při průchodu ionizujícího záření vhodnou látkou (scintilátorem). Pro detekci g-záření se jako scintilační jednotky používají krystaly NaI/Tl. Při průchodu záření gama scintilačním krystalem dochází k fotoefektu a ke Comptonově rozptylu. Elektrony uvolněné z atomových obalů excitují atomy krystalu, přitom vzniká viditelné luminiscenční záření zvané scintilace. Pro přeměnu scintilací na elektrické impulsy se používají fotonásobiče. Systém LB 2111 je vybaven 12 scintilačními jednotkami a fotonásobičem. ReagencieOSN-E 1. Zkumavky potažené polyklonální protilátkou proti 17-OH progesteronu: 2x 50 zkumavek. 2. Radioindikátor - značený ^125I: 1 lahvička (45 ml); připravená k použití. Lahvička obsahuje aktivitu 640 kBq (ke dni výroby) 17-OH progesteronu značeného ^125I roztoku s hovězím sérovým albuminem, obsahuje azid sodný. 3. Standardy: 6 lahviček (0,5 ml); kalibrační rozmezí 0-37 ng/ml (111,96 nmol/l). Koncentrace jsou uvedeny na lahvičkách. 4. Kontrolní vzorky: 2 lahvičky (0,5 ml): lyofilizovaný, před použitím rozpustit v destilované vodě, její objem je uveden na lahvičce. Aktuální koncentrace je znázorněna na lahvičce. 5. Promývací roztok: 1 lahvička (50 ml): rozpustit v 950 ml destilované vody. Takto je stabilní až do data expirace. Všechny reagencie soupravy uschovávejte v lednici při 2-8 °C. Aktuální koncentrace standardů a kontrolních materiálů jsou zaznamenány na lahvičkách. Pracovní postup 1. Nechte všechny reagencie vytemperovat na laboratorní teplotu. 2. Očíslujte duplikátní sérii potažených zkumavek. Do každé zkumavky napipetujte 25µl kalibrátoru, kontrolních vzorků a pacientských sér. Nachystejte i zkumavku pro celkovou aktivitu (T) 3. Do každé zkumavky napipetujte 400 µl radioindikátoru. 4. Zkumavky promíchejte na vortexu, zakryjte parafilmem a nechte inkubovat v třepačce na 2 hodiny. 5. Odsajte a promyjte pomocí 2 ml promývacího roztoku zkumavky pro celkovou aktivitu (T). Celkem dvakrát!!! 6. Zvolte vyhodnocovací program RIA 17- OH a změřte radioaktivitu zkumavek – v gama-čítači nastaveném na ^125I, po dobu 1 minuty. Tím získáte vázané cpm (B) a celkovou aktivitu (T). Schéma pracovního postupu Krok 1 dávkování Krok 2 Inkubace Krok 3 měření Do potažených zkumavek dávkujte: · 25 μl vzorku, standardu, kontrolního vzorku · 400 μl radioindikátoru · Zakryjte parafilmem Inkubujte 2 hodiny při 18-25°C za třepání Pečlivě odsajte a promyjte pomocí promývacího roztoku a odsajte obsah zkumavek. Promytí 2x kromě zkumavky pro celkovou aktivitu. Změřte vázané cpm (bound) a celkové cpm (Total) Vyhodnocení Vyhodnocení se provádí pomocí kalibrační křivky, kdy na osu x se vynáší koncentrace v nmol/l a na osu y poměr B/Bo. Přepočítací faktor: ng/ml x 3,026= nmol/l Total Bo STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 impulzy C teoret. C měřená kontroly impulzy c naměřená K1 K2 vzorky impulzy c naměř. 3. Klinická interpretace: uvést referenční rozmezí M, Ž + příklady ↓ a ↑ klinických hodnot. 4. Proč se provádí u dětí do 6 měsíců věku extrakce? 5. Popis bezpečnosti v RIA laboratoři (příklad kontrolní test ověření znalostí), monitorování pracovního prostředí v RIA laboratořích. 6. Fyzikální poločas rozpadu u ^125I? Jaké jsou výhody a nevýhody stanovení RIA?