IZOLACE NK A REAL-TIME PCR Doc. RNDr. Sabina Ševčíková, PhD BMS, UPF LF MU DNA a RNA •DNA •RNA –mRNA - mediátorová –tRNA - transferová –rRNA - ribozomální Molekulární diagnostika •Diagnostika na úrovni DNA, RNA • •Analýza kvalitativní a kvantitativní Izolace DNA a RNA •Zisk DNA nebo RNA v dostatečném množství a čistotě •Kvalita rozhoduje o úspěchu dalších metod •Vliv metody na další použití • • • Přístupy k izolaci DNA buňka DNA RNA proteiny Lýza biomembrán Nukleové kyseli-ny zůstávají v roztoku, bílkovi-ny se sráží a se-dimentují odstře-děním na rozhra-ní, lipidy jsou ex-trahovány do chloroformu vodný roztok (DNA, RNA) chloroform(lipidy) Rozhraní (bílkoviny) RNA je příp. odstraněna RNázou A. Odstraňujeme lipidy extrakcí chloro-formem, bílkoviny srážením fenolem B. Za určitých podmínek absorbujeme DNA na povrch SiO2, ostatní odsajeme SiO2 je obvykle v podobě skleně-ných částic, které jsou těžké, snad-no sedimentují, ostatní lze odsát. Změnou podmínek dojde opět k uvolnění DNA do čistého roztoku Kolonky Qiagen buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění Izolační kolonky mRNA kolonky 2 Izolace RNA Image1_rot 28S 18S Kvantifikace NK - nanodrop •Kvantifikace DNA, RNA, proteinů •Bezkyvetový spektrofotometr •Měří 0,5-2ul vzorku •Od 5ng/ul do 3000 ng/ul •260/280nm •260/230 nm RNA extrakce •Z čerstvého materiálu •RNA uskladněna v -80C nebo ve speciálních roztocích •Zpracovávat 10-20 vzorků •DNAse I ke zbavení kontaminace DNA • RNA kontrola kvality •Vysoká čistota (bez kontaminací) •Vysoká integrita (bez degradace) •Jakékoliv nečistoty – inhibice PCR (proteiny) •OD 260/280 1.8-2.0 bez proteinů •OD 260/230 1.8-2.0 bez organických nečistot •RIN>7 •Konsistentně používat čistotu a integritu – redukce variability • Čistota •260/280 nm – 1,8 čistá DNA, 2,0 čistá RNA (nižší – proteiny, fenol) •260/230 nm – 2-2,2 (EDTA, fenol) •Záleží na koncentraci – pokud moc nízká, čistota nebude dobrá • Templát – Izolace RNA - -Integrita (RNA Integrity Number – RIN) výpočet na základě 28S a 18S rRNA -Čistota (A260/280; A260/230), přítomnost PCR inhibitorů -Přesné určení koncentrace RNA -Celková RNA nebo mRNA? -Vhodnost metody, automatizace, výtěžek… RIN RIN Manipulace •RNA velice nestabilní, pracovat na ledu, okamžitě zamrazit •Stabilita v -80C cca 1 rok – lepší skladovat cDNA •DNA poměrně stabilní •Co udělá UV s NK? Reverzní transkripce (RT) •Proces přepisu RNA do cDNA (komplementární DNA) •Primery, reverzní transkriptáza, dNTP, pufr (Mg2+) •Primery: oligo dT, random hexamers, gene specific •Reverzní transkriptázy: HIV, AMV, MMLV • RT •Hned po izolaci •Vždy stejné množství RNA do reakce a stejně přepsat •Kontroly: –no RT (kontrola kontaminace genomickou DNA) –no template control (kontaminace) – Základní vybavení labina cela transluminator cycler2 transluminátor cycler elfo a centrifuga_vyrez 1952 Elektroforéza 1967 • Rekombinantní DNA • Objev DNA ligázy 1969 FISH 1970 • Restrikční endonukleázy • Reverzní transkriptáza 1972 Klonování 1973 In vitro konstrukce bakteriálního plazmidu 1975 Southern blot 1977 Sekvenování DNA 1980 Koncept RFLP 1981 Western blotting 1982 • Manipulace s genomem Drosophily – P elementy • Whole genome shotgun Molekulární technologie 1984 Pulzní gelová elektroforéza 1985 • PCR • DNA fingertyping 1987 • YACs • Místně cílená mutageneze 1988 Taq Polymeráza ChIP 1990 BLAST 1992 BACs 1995 Microarrays 1998 RNAi 2002 UCSC Genome Browser 2003 DNA assembly programs 2004 Anotace genů – ENSEMBL 2005 • Projekt HapMap • Ligační sekvenování 2006 Celogenomové metylační mapy 2007 miRNA 2009 Next Generation Sequencing What about DNA? • Maurice Wilkins-James Watson-Francis Crick- Rosalind Franklin, 1953 • Dr. Franklin died in 1958 • Nobelova cena Wilkins-Watson-Crick,1962 • model dsDNA King’s College London Southern blot, RFLP, … Northern/Western blot, Flowcytometrie, … Kultivace, biochemické analýzy Cytogenetické vyšetření Molekulární technologie 1.zda pacient nese nějakou klinicky významnou bodovou mutaci, která určuje jeho další léčbu? 2. 2. 2.který ze dvou genů je v nějaké tkáni exprimován více než druhý ? 3. 3.druh patogenní bakterie u nemocného? 4. 4. 4.zastoupení leukemických buněk v krvi pacienta před a po léčbě? Jakým způsobem zjistíte: C:\Users\Petr\AppData\Local\Microsoft\Windows\Temporary Internet Files\Content.IE5\3KSRIUGF\MCj04077340000[1].wmf PCR Kary B. Mullis Praktická aplikace PCR 1987-8 • Použití termostabilní DNA polymerázy • Rozvedení konceptu navrženého K. Kleppem • Obrovský boom PCR díky technologickému pokroku • • • 363 629 článků (27.11.2008) • 399 022 (1.12.2009) • 428 622 (15.12.2011) Nobelova cena za chemii 1993 PCR Cyklické střídání fází denaturace, annealingu a extenze jednoduchou změnou teploty reakční směsi Polymeráza využívá syntetické primery ohraničující amplifikovaný úsek DNA Amplifikace DNA pcranim Základní komponenty reakce •voda •pufr •dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) •MgCl2 •Taq polymeráza • •primers •templát Teplotní režim •96ºC Iniciální denaturace •96ºC denaturace •40-72ºC annealing •72ºC elongace •72ºC závěrečná elongace •4ºC zchlazení 30x Kvantifikace pomocí PCR Konvenční kvantitativní PCR -„End point“ stanovení • Kvalitativní odpověď YES/NO • Extenzivní validace, kontroly • Denzitometrie • Minimální rozptyl v parametrech reakce má obrovský vliv na množství amplikonu • Interní heterologní kontrola (housekeeping gene) •Viral load u HIV+ pacientů • Výskyt minimální reziduální choroby u onkologických pacientů Calibration.jpg qpcr.jpg Kvantifikace pomocí PCR „End point“ Kvantifikace pomocí PCR „End point“ Zásadní omezení – gelová elektroforéza • Nízká přesnost • Nízká citlivost • Malý dynamický rozsah – pouze 2log. • Nízké rozlišení, pouze na délce amplikonu • Není automatizovaná • Výstup není numerický – subjektivní hodnocení • EtBr – neváže se na DNA pravidelně • Post PCR zpracování - kontaminace Kvantitativní vztah mezi množstvím PCR produktu (amplikonu) a intenzitou fluorescence • • Amplifikační práh detekce (Ct) Real – time detekce amplifikace Plateau fáze Exponenciální amplifikace pod úrovní pozadí Exponenciální fáze „end point“ „real-time“ Real-time Fluorescence Based PCR Real – time detekce amplifikace Fluorescence R je zajištěna např. vazbou fluorescenčního interkalačního barviva na DNA, použitím hydrolyzační sondy atd. Fluorescence reportérového fluoroforu je normalizována vůči pasivnímu fluoroforu (Rox) - Rn. Změnu fluorescence v čase vůči pozadí udává DRn. (DRn=Rn+-Rn-). Threshold cycle „Ct“ – určený na základě hodnoty fluorescence pozadí (backround) a aktuální fluorescence vzorku – kvantitativní výstup pro každý vzorek Real – time detekce amplifikace - Ct Threshold Threshold cycles Background Fluorescence Threshold cycle „Ct“ - počáteční množství kopií templátu - definovaný v exponenciální fázi PCR - stejná účinnost PCR ve všech reakcích - účinnost štěpení fluorogenní sondy nebo vazby fluoroforu na DNA - citlivost detekce - čím menší Ct - tím větší počet kopií templátu na začátku reakce Real – time detekce amplifikace - Ct ampl-plot2.jpg A C B A C B > > - rozdíl 1 Ct – dvojnásobné množství templátu 21 = 2 - kolika cyklům odpovídá odpovídá 10ti násobný rozdíl v množství templátu? (předpokládáme 100% účinnost PCR) 2n = 10 Threshold cycle „Ct“ Real – time detekce amplifikace - Ct 50 100 150 250 300 0 c [ng/ml] Ct 50 28,16 100 27,16 150 26,66 250 26,06 300 25,66 n=3,32 Kontaminace PCR Cross contamination Carry-over contamination PCR 1 PCR 2 PCR 2 PCR 1 Vzorek 1 Vzorek 2 Přenos amplikonu do dalších PCR Vzájemná kontaminace vzorků Jak předejít kontaminaci Kontaminace • Správná laboratorní praxe • Plastik v RNA kvalitě • Automatizace ´ www.millipore.com; www.appliedbiosystems.com Application note: Contamination-pipetting: relative efficiency of filter tips compared to Microman® positive displacement pipette. Nature Methods 3 June 2006 Gelová elektroforéza Gelová elektroforéza •Metoda pro separaci a analýzu molekul DNA, RNA, proteinů •Závislost na velikosti, uspořádání a náboje •DNA putuje od záporného ke kladnému pólu •Agaróza •Etidium bromid •Sybr green Elektroforéza v agarovém gelu onk_ban_462_492_2 Animation2 + - Příště •Izolace RNA pomocí Qiagen kolonek Postup