19.03.2021
1
Praktické cvičení 1
Mikrobiologie I, BSP LF MUNI
Distanční výuka, LS 2020/2021
doc. MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.
Obsah cvičení
• Kultivace mikroorganismů
• Kvalitativní stanovení
• Kvantitativní stanovení
• Stanovení celkového počtu mikroorganismů
• Stanovení počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae
• Stanovení počtu Escherichia coli
• Stanovení počtu enterokoků
Kultivace
mikroorganismů
Základní informace
Kvalitativní stanovení Kvantitativní stanovení
• přítomnost / nepřítomnost MO
• vztaženo k navážce analytického
vzorku (např. negativní v 25 g)
• přesný počet MO
• KTJ v 1 g či ml vzorku
• KTJ = kolonie tvořící jednotka
• pomnožení (jednostupňové x
dvoustupňové)
• izolace (kličkou, tyčinkou)
• konfirmace
• definitivní výsledek
• desetinásobné ředění vzorku
• inokulace (zalití x roztěr)
• počítání suspektních kolonií
• konfirmace
• definitivní výsledek
Kvalitativní stanovení
(průkaz)
Pomnožení
• tekuté médium, cíleně zvyšujeme počet buněk daného MO
• neselektivní x selektivní pomnožovací média
• Postup: dané množství upraveného vzorku či suspenze přeneseme
do daného množství tekutého živného média a promícháme
Jednostupňové pomnožení
Dvoustupňové pomnožení
selektivní médium
neselektivní médium selektivní médium
poloselektivní médium
19.03.2021
2
Izolace
• pevné médium
• Postup: pomnožený vzorek naneseme na povrch agaru, kde ho cíleně
ředíme tak, aby došlo k nárůstu izolovaných kolonií
• Metody: vyočkování sterilní kličkou (křížový roztěr) nebo tyčinkou
(had)
Křížový roztěr kličkou
Zdroj obrázku: https://cz.clipartlogo.com/istock/camcorder-symbol-flat-vector-1548272.html
https://web.microsoftstream.com/video/f5c221bc-
5fe1-496b-91e6-5fbd21a0368d?list=studio
1. 2. 3. 4. 5.
Vyočkování sterilní tyčinkou (had)
Zdroj obrázku: https://cz.clipartlogo.com/istock/camcorder-symbol-flat-vector-1548272.html
https://web.microsoftstream.com/video/154c94ed-
97e8-4cac-8d58-d6bcf0ec691c?list=studio
Konfirmace
• potvrzení, že se skutečně jedná o sledovaný mikroorganismus
• fenotypová x genotypová
• konfirmujeme suspektní (typické) kolonie z dané živné půdy
• povinné fenotypové konfirmační metody jsou vždy definovány
příslušnou metodikou (norma ČSN EN ISO) popisující stanovení
daného MO
Kvantitativní stanovení
(počet)
Zpracování vzorku
navážka vzorku
přídavek ředicího média
10 g (počet) × 25 g (průkaz, není-li dáno jinak)
vždy 9× více než navážka (10 g  90 ml)
homogenizace stomacher (1,5 až 2 min) = primární ředění
další desetinásobná ředění 9 ml ředicího média + 1 ml suspenze z
předchozího kroku
19.03.2021
3
Zpracování vzorku – pevné, kašovité Výchozí ředění – pevné, kašovité
Zdroj obrázku: https://cz.clipartlogo.com/istock/camcorder-symbol-flat-vector-1548272.html
https://web.microsoftstream.com/video/0969a89f-
447f-4ca1-890b-27eb6ec84377?list=studio
https://web.microsoftstream.com/video/8fa81085-
6419-445a-8036-e3a49f1218f0?list=studio
Zpracování vzorku – tekuté Výchozí ředění – tekuté
Zdroj obrázku: https://cz.clipartlogo.com/istock/camcorder-symbol-flat-vector-1548272.html
https://web.microsoftstream.com/video/d30df57f-
d2af-4e6f-886a-8b4afb5a8545?list=studio
Ředění vzorku Další desetinásobná ředění
Zdroj obrázku: https://cz.clipartlogo.com/istock/camcorder-symbol-flat-vector-1548272.html
https://web.microsoftstream.com/video/a52a877d-
1bf5-4506-b63f-89605a2c9aa7?list=studio
19.03.2021
4
Kvantitativní techniky
ZALITÍ ROZTĚR
• vždy 1 ml inokula • obvykle 0,2 ml (příp. 0,1 či 1 ml)
• prázdná Petriho miska
• do středu pipetujeme inokulum
• zalijeme cca 15 ml agaru (max. 50 °C)
• promícháme krouživými pohyby
• necháme ztuhnout
• inkubace dnem vzhůru
• Petriho miska s živnou půdou
• na povrch pipetujeme inokulum
• roztěr sterilní hokejkou
• zaschnutí max. 15 minut
• inkubace dnem vzhůru
Metoda zalití
Zdroj obrázku: https://cz.clipartlogo.com/istock/camcorder-symbol-flat-vector-1548272.html
https://web.microsoftstream.com/video/80e4c001-
eee8-44a1-96a8-47622f07dfba?list=studio
Metoda roztěru
Zdroj obrázku: https://cz.clipartlogo.com/istock/camcorder-symbol-flat-vector-1548272.html
https://web.microsoftstream.com/video/6621ad9f-
bbe1-4a75-a98f-57c949ef79fc?list=studio
5 minut
přestávka
Stanovení celkového počtu
mikroorganismů (CPM)
Počet mezofilních aerobních a fakultativně
anaerobních mikroorganismů (bakterie,
kvasinky a plísně), které rostou v neselektivních
nutričně bohatých médiích nebo tvoří kolonie
na nutričně bohatých agarových půdách za
aerobních podmínek během inkubace při 30 °C
po dobu 72 hodin.
Celkový počet mikroorganismů (CPM)
19.03.2021
5
Vyhodnocení
CPM – ukázka výsledků
ředění 10-2 – obě PM cca 150 KTJ ředění 10-3 – 12 a 17 KTJ
CPM – ukázka výsledků
ředění 10-2 – 31 a 26 KTJ ředění 10-3 – 1 a 2 KTJ
ředění 10-2 ředění 10-3
CPM – ukázka výsledků
Stanovení počtu bakterií čeledi
Enterobacteriaceae
19.03.2021
6
• gramnegativní
• nesporulující tyčinky
• oxidáza negativní
• fermentace glukózy s tvorbou kyseliny a
plynu
• významný indikátor fekální kontaminace či
nedostatečně provedeného tepelného
ošetření
EB
čeleď Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
VČŽG agar
OXI test – průkaz oxidázy
Princip metody
Enzym cytochromoxidáza je detekován barevnou reakcí N,N-dimethyl-1,4fenylendiaminu
s α-naftolem za vzniku indolfenolové modři.
pozitivní negativní
Gramnegativní
bakterie
Průkaz glykozidáz
Princip metody
K průkazu se používají tekuté půdy obsahující testovaný cukr a indikátor pH
(bromthymolová modř, fenolová červeň). Zkvašuje-li testovaná kultura daný cukr,
dojde ke změně barvy média z původní zelené, resp. červené, na žlutou. Přidání
plynovky umožňuje současně sledovat tvorbu plynu.
Escherichia coli Salmonella spp.
pozitivnínegativníL= laktóza
G = glukóza
19.03.2021
7
https://web.microsoftstream.com/video/cfe49bd6-
94ce-4ac3-bf1e-cc992891188c?list=studio
Stanovení Enterobacteriaceae v syrovém mléce
Stanovení počtu
Escherichia coli
KB
EB
EC
Escherichia coli
• gramnegativní
• nesporulující tyčinky
• oxidáza negativní
• fermentace glukózy s tvorbou kyseliny a plynu
+
• fermentace laktózy s tvorbou kyseliny a plynu
+
indol pozitivní
β-D-glukuronidáza pozitivní
Escherichia coli
TBX agar
19.03.2021
8
substrát chromofor
BAKTERIE
CHROMOGEN
Princip chromogenních médií
obvykle se jedná o selektivně diagnostické půdy
substrát chromofor
BAKTERIE
β-D-glukuronidáza
Princip chromogenních médií
chromofor
chromofor
chromofor
chromofor
chromofor
chromofor
Princip chromogenních médií COLI test
Princip metody
Přítomnost indolu se indikuje přídavkem Kovácsova činidla (pdimethylaminobenzaldehydu).
V pozitivním případě vzniká sytě růžový až červený
reakční produkt.
Princip metody
Enzym ß-D-glukuronidasa štěpí 4-methylumbelliferyl-ß-D-glukuronid, vzniklý 4methylumbelliferon
vykazuje pod UV modrou fluorescenci.
Tvorba indolu
Aktivita β-D-glukuronidázy
COLI test
Tvorba indolu Aktivita β-D-glukuronidázy
negativnípozitivní
pozitivní
Escherichia coli je v obou znacích pozitivní
https://web.microsoftstream.com/video/fcc8e884-
821d-431f-9226-b211028bbb80?list=studio
Stanovení počtu E. coli v majonézovém salátu
19.03.2021
9
Stanovení počtu
enterokoků
• grampozitivní koky (často diplokoky, krátké
řetízky)
• kataláza negativní
• vysoce odolné (6,5 % NaCl, pH 9,6 a 40 % žluči)
• termorezistentní 60 °C po dobu 30 minut
• hydrolýza eskulinu
• indikátory fekální kontaminace
• Enterococcus faecalis, E. faecium a další druhy
Zdroje obrázků: https://euroclean.cz/problemy-vody/bakterie/;
https://www.zdravie.sk/clanok/57496/crevne-enterokoky-ake-choroby-mozu-sposobit
Enterococcus spp.
Enterococcus spp.
Bile-esculin agarSlanetz-Bartley agar
https://web.microsoftstream.com/video/f0e916f3-
dbc4-4345-9f08-c57612f89da7?list=studio
Stanovení počtu enterokoků v sušeném mléce
19.03.2021
10
Děkuji za pozornost