LF – PRAKTICKÉ CVIČENÍ 2 DISTANČNÍ FORMA VÝUKY LS 2020/2021 NÁPLŇ CVIČENÍ 1. CPM – ukázka narostlých Petriho misek 2. Vyhodnocení výsledků plotnových metod – teoretický úvod + procvičení 3. Ukázka typického růstu vybraných patogenních bakterií 4. Stanovení reziduí inhibičních látek v potravinách (RIL) 1. CPM – UKÁZKA PM ředění 10-2: 32 KTJ a 30 KTJ ředění 10-3: 4 KTJ a 2 KTJ VÍCE KONTAMINOVANÉ ředění 10-2 ředění 10-3 NEHODNOTITELNÉ ředění 10-2 ředění 10-3 2. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ PLOTNOVÝCH METOD OBECNÉ ZÁSADY VZOREC – 2 ŘEDĚNÍ PŘÍKLAD VYPOČÍTEJTE – ZADÁNÍ Výsledek napište na chat probíhající akce. VYPOČÍTEJTE – ŘEŠENÍ Kdo měl správně zapíše si bod ☺. VZOREC – 1 ŘEDĚNÍ PŘÍKLAD VYPOČÍTEJTE – ZADÁNÍ Výsledek napište na chat probíhající akce. B. cereus max. 150 KTJ na PM VYPOČÍTEJTE – ŘEŠENÍ Kdo měl správně zapíše si druhý bod ☺. ODHAD POČTU – MÉNĚ NEŽ 10 KTJ PŘÍKLAD VYPOČÍTEJTE – ZADÁNÍ Výsledek napište na chat probíhající akce. VYPOČÍTEJTE – ŘEŠENÍ Kdo měl správně zapíše si další bod ☺. ODHAD POČTU – MÉNĚ NEŽ PŘÍKLAD VYPOČÍTEJTE – ZADÁNÍ Výsledek napište na chat probíhající akce. VYPOČÍTEJTE – ŘEŠENÍ Kdo měl správně zapíše si bod ☺. ODHAD POČTU – VÍCE NEŽ PŘÍKLAD VYPOČÍTEJTE – ZADÁNÍ Výsledek napište na chat probíhající akce. enterokoky max. 150 KTJ na PM VYPOČÍTEJTE – ŘEŠENÍ Kdo měl správně zapíše si opět bod ☺. HODNOCENÍ SAMOSTATNÉ PRÁCE • sečtěte si získané body a podívejte se, jak jste dopadli ☺ Body Hodnocení 5 perfektní výsledek, asi vám odpustíme kontrolní test 4 výborně, můžete bez obav hned psát písemku 2 – 3 dobře, něco se povedlo, ale ještě to není ono 0 – 1 bohužel, je třeba důkladné samostudium 3. UKÁZKY TYPICKÉHO RŮSTU VYBRANÝCH PATOGENNÍCH BAKTERIÍ Bakterie rodu Salmonella - průkaz • gramnegativní tyčinky (Enterobacteriaceae) • obvykle pohyblivé • produkce sirovodíku • laktóza negativní • salmonelóza (zoonóza) Zdroje obrázků: https://about-salmonella.com/ Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (2 druhy, 6 poddruhů, více než 2500 serovarů) XLD agar BR agar LISTERIA MONOCYTOGENES Listeria monocytogenes • grampozitivní krátké tyčinky (Listeriaceae) • pohyblivé do 25 °C • listerióza (zoonóza) • rizikové skupiny • afinita k CNS a gravidní děloze Zdroj obrázku: https://www.fda.gov/food/foodborne-pathogens/listeria-listeriosis ALOA agar PALCAM agar Stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků (S. aureus) Staphylococcus aureus • grampozitivní koky (Staphylococcaceae) • hroznovité shluky • fakultativně anaerobní • nepohyblivé • produkuje žlutý pigment • 10 % NaCl, aktivita vody 0,86 • stafylokoková enterotoxikóza (termostabilní SEs) • alimentární intoxikace Zdroj obrázku: https://mb-labs.com/testlibrary/staphylococcus-aureus/ Alternativa: technika s použitím půdy s králičí plazmou a fibrinogenem (RPF agar), precipitace Baird-Parker agar Stanovení počtu Bacillus cereus Bacillus cereus • grampozitivní tyčinky (Bacillaceae) • jednotlivě či krátké řetízky • fakultativně anaerobní • pohyblivý • tvorba vysoce odolných endospor • emetický syndrom (emetický toxin = cereulid) • diarhogenní syndrom (různé enterotoxiny) Zdroj obrázku: https://cz.123rf.com/photo_63439523_bacillus-cereus-gram-pozitivn%C3%AD-v%C3%BDtrus-produkovat-bakterie- uspo%C5%99%C3%A1dan%C3%A9-v-%C5%99et%C4%9Bzc%C3%ADch-kter%C3%A9-zp%C5%AFsobuj%C3%AD-otr.html MYP agar Krevní agar Stanovení termotolerantních druhů Campylobacter spp. Campylobacter spp. • gramnegativní zakřivené tyčinky (spirily) • mikroaerofilní • pohyblivé • nefermentují sacharidy • termotolerantní – optimální teplota růstu 42 °C • C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis Zdroj obrázku: https://badgut.org/information-centre/health-nutrition/campylobacter/ Bolton medium mCCDA agar Stanovení Cronobacter spp. Cronobacter spp. • gramnegativní tyčinky (Enterobacteriaceae) • dříve Enterobacter sakazakii • fakultativně anaerobní • pohyblivý • produkce žlutého pigmentu • extrémní přežívání v suchém prostředí • nekrotická kolitida a meningitida Zdroj obrázku: https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fblog.microbiologics.com%2Fenvironmental-isolate-case-file-cronobacter- sakazakii%2F&psig=AOvVaw3u4wXjc_2IkJIbF2ZHTABH&ust=1605417880574000&source=images&cd=vfe&ved=0CAIQjRxqFwoTCNijt-qlge0CFQAAAAAdAAAAABAD 4. Stanovení reziduí inhibičních látek (RIL) v potravinách Používané metody Inhibiční látky - látky, které omezují nebo zastavují růst mikroorganismů. Metody stanovení: • plotnové metody • komerční širokospektrální testy (např. Eclipse 50 test, BR test) • selektivní rychlotesty používané hlavně pro prvotní diagnostiku v mlékárnách (např. Beta-Star test, Delvo-X-Press test) Metodický pokyn na stanovení reziduí inhibičních látek ve tkáních, mléce, vejcích a potravinách ze dne 1. 6. 2008 Plotnové metody • princip: agarový difúzní test • vzorky se kladou na Petriho misku obsahující agarovou půdu inokulovanou testovacím kmenem • růst testovacího kmene se projeví zakalením agaru po inkubaci • difúze RIL se projeví tvorbou zóny inhibice růstu testovacího kmene okolo vyšetřovaného vzorku Používané plotny Inkubační podmínky Kontrola citlivosti • v den testování při použití jedné šarže půd dáváme kontrolní disk s pozitivní kontrolou jen na jednu testovací plotnu • sterilní pinzetou umístíme na plotnu sterilní papírový disk o průměru 6 mm (plotny 1-5) nebo 9 mm (plotna 6) • na povrch disku pipetujeme příslušný roztok antibiotika v množství 10 µl (plotny 1-5) nebo 30 µl (plotna 6) • po inkubaci ploten změříme velikost vzniklých inhibičních zón a porovnáme s doporučenými hodnotami Pracovní postup – mléko Pracovní postup tkáně, vejce • sterilními nůžkami z hloubky tkáně vystřihneme vzorek o velikosti 7x7x7 mm • vzorek umístíme na povrch agaru v Petriho misce • plotny se inkubují dnem dolů (neobracet!) • vzorek vajec (melanž) upravíme a tepelně inaktivujeme (70 °C / 20 minut) • dávkujeme do sterilních kovových válečků (100 μl) Vyhodnocení inhibiční zóna v mm DĚKUJI ZA POZORNOST ☺