Imunoanalýza ELISA Mgr. Julie Štíchová Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně Ústav klinické imunologie a alergologie Imunoanalytické metody Rozdělení metod dle typu značky: oEIA – značkou je enzym oRIA - radioizotop oLIA - luminofor oFIA - fluorofor Rozdělení metod dle uspořádání: oHomogenní – bez promývání oHeterogenní – s promýváním oKompetitivní oNekompetitivní Vizualizace reakce antigen-protilátka pomocí značky Imunoanalytické metody Heterogenní kompetitivní: oAnalyt ze vzorku + značený analyt od výrobce – soutěž o omezené množství antigenu oMěřený signál je nepřímo úměrný množství analytu Heterogenní nekompetitivní: oDetekční protilátka / antigen v nadbytku –analyt ze vzorku vyvázán oMěřený signál je přímo úměrný množství analytu ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay oHeterogenní imunoanalýza – nutná separace nezreagovaných složek pomocí promývání o Zahrnuje jednotlivé kroky o Vazba antigenu / protilátky na pevnou fázi (stěna destičky) o Na navázaný Ag se váže zkoumaná protilátka z přidaného séra o Na navázaný komplex se váže sekundární protilátka s konjugovaným enzymem o Pro vizualizaci se do reakce přidá substrát pro daný enzym - enzymatická přeměna substrátu na barevný produkt – měření na spektrofotometru o Používané enzymy: o Křenová peroxidáza (tetrametylbenzidin  tetrametylbenzimidin  450 nm) o Alkalická fosfatáza (p-nitrofenylfosfát  nitrofenol  405 nm) o Mezi výše uvedenými jednotlivými kroky je vždy tzv. promýváním, při kterém se nadbytek reaktantu odstraní přídavkem pufru do jamky, který je pak také z jamky odstraněn – separace nezreagovaných složek oVysoká citlivost – pg/ml Kautování ELISA desky oImobilizace Ag nebo Ab na plastový povrch desky 1. Povrchová aktivace desky ◦ vazba NH2 nebo COOH skupin – tvorba kovalentních vazeb s protilátkou nebo antigenem ◦ Vhodné pro stanovení malých molekul – např. peptidy 2. Pasivní adsorpce ◦ Hydrofobní interakce mezi nepolárními strukturami proteinu a plastovým povrchem desky ◦ Protein určený k adsorpci je rozpuštěn v alkalickém kautovacím pufru (pH 9,5) – naleptává plastový povrch a usnadňuje adsorpci Ag nebo Ab o Blokování desky o Po navázání Ab/Ag zůstává část plastového povrchu volná. Aby bylo zabráněno nespecifickým vazbám, je nutno tato místa zablokovat inertní bílkovinou BSA – bovinní sérový albumin Vlastní průběh ELISY Za každým krokem následuje tzv. promývací krok, kde se obsah jamky odsaje, do jamky se přidá nejčastěji fosfátový pufr a následně se obsah jamky odsaje. Toto promytí se opakuje zpravidla 3x za sebou, aby byl odstraněn veškerý nezreagovaný materiál. Systém záchytná + detekční Ab oDetekční (sekundární) protilátka proti hledanému Ag je konjugovaná s enzymem, oProč je každá protilátka od jiného živočišného druhu? Záchytná protilátka myší, polyklonální Detekční protilátka humánní, monoklonální Lidská monoklonální protilátka – s vysokou specifitou váže pouze konkrétní antigen Záchytná protilátka – s vysokou senzitivitou váže všechny varianty daného antigenu Tato kombinace významně snižuje riziko zkřížené reaktivity, která by mohla způsobit vznik nespecifických imunokomplexů (zdroj falešné pozitivity)!!! Vyšetřovaný Ag v séru Enzymatická detekce – přidání substrátu Nejčastěji používané enzymy detekčních nebo-li sekundárních protilátek: ◦ Křenová peroxidáza ◦ Alkalická fosfatáza Pro křenovou peroxidázu jsou používány tyto substráty: • 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin – modré zbarvení + stop činidlo  žluté zbarvení – odečet při 450nm • 2, 2´-azinobis(3-ethylbenzthiazol-6sulfonát) • o-fenylendiamin • o-dianisidin • o-toulidin Pro alkalickou fosfatázu se používá substrát • 4-nitrofenylfosfát Luminscenční Immunoassay • Chemiluminscenční substráty – detekce záblesků luminiscence • SuperSignal • ECL Sendvičová ELISA - uspořádání oDetekce analytů s vysokou Mr (proteiny) oVysoká přesnost http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html oPoužití dvou protilátek specifických na různé epitopy jednoho antigenu. oJedna z protilátek je navázána na povrch jamky destičky a vychytává antigen ze vzorku. oDruhá protilátka značená enzymem slouží k detekci tohoto antigenu. oAntigen je tedy mezi protilátkami jako plátek masa mezi houskami v sendviči. Sendvičová ELISA –vyšší senzitivita oSystém biotin – avidin/streptavidin – na jeden imunokomplex se váže více molekul enzymu oPo přídavku substrátu vzniká silnější zbarvení (pro analyty s nízkou koncentrací) Sendvičová ELISA využívající divalentní vazby některých autoprotilátek oDiabetes mellitus I. typu o Autoprotilátky proti dekarboxyláze kyseliny glutamové (anti-GAD) o Autoprotilátky proti zinkovému transportéru ZnT8 (anti-ZnT8) oDestička pokryta Ag oVazba auto-Ab jedním Fab fragmentem na Ag oDruhý Fab fragment váže biotinem značený antigen ze setu oPřídavek streptavidinem značeného enzymu oPřídavek substrátu  zbarvení Autoprotilátka má schopnost vázat se divalentně Kompetitivní ELISA - uspořádání oDetekce analytů s malou Mr http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html o Na rozdíl od nekompetitivní ELISY se navíc přidává enzymem značený Ag. o Přidaný enzymem značený antigen kompetuje – soutěží - s hledaným Ag v séru o vazebné místo zkoumaného Ag. o Čím více je zkoumaného Ag v séru, tím méně se naváže enzymem značeného Ag a tím nižší je pak měřená absorbce. Měření výsledků oPřístroj ELISA reader oPrincip – vertikální spektrofotometrie oZdroj světla – Xe výbojka oVýběr vlnové délky – interferenční filtry oOptická dráha – 9 optických vláken (8 měří vzorky, 9. vlákno kontrola intenzity záření) o9 detektorů - fotodiody Podrobnější popis – skripta instrumentální techniky. Doc. Dastych a kol. Výsledky 1. Kvalitativní ◦ Hodnotíme vizuálně přítomnost / nepřítomnost reakce  ano / ne – výsledek je pak pozitivní či negativní, použití cut-off kalibrátoru, hodnoty s absorbancí nad tuto hodnotu jsou hodnoceny jako pozitivní 2. Semi-kvantitativní ◦ IP (index pozitivity) = absorbance vzorku / absorbance cut-off kalibrátoru 3. Kvantitativní ◦ Kalibrační křivka – ředění kalibrátoru o známé koncentraci analytu ◦ Výsledek (absorbance = OD, optická denzita) se odečítá z kalibrační křivky ◦ Přepočet absorbance na koncentraci (Lambert-Beerův zákon) ◦ Výsledek má číselnou hodnotu s udanými jednotkami (např. U/ml, ug/ml) Hodnocení výsledků - kvantitativní Kalibrační řada Blank Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky pacientů Využití ELISA v imunologii oAntiinfekční imunita oStanovení protilátek proti některým infekčním agens oAutoimunitní onemocnění oStanovení autoprotilátek ELISA a antiinfekční imunita oStanovení přítomnosti protilátek proti vybraným infekčním agens o Protilátky proti tetanickému toxoidu o Protilátky proti difterickému anatoxinu o Protilátky proti kapsul. antigenu Haemophilus influenzae typ b o Protilátky proti specifickému pneumokokovému kapsulárnímu polysacharidu (anti-PCP) Jak reaguje imunitní systém pacienta? Sledování imunitní odpovědi na vakcinaci  zájem především o snížené hladiny  podezření na imunodeficience! Mikrobiologie Imunologie Čím se pacient nakazil? Diagnostika probíhající / prodělané infekce Očkování ELISA stanovení autoprotilátek u autoimunitních onemocnění oAnti-dsDNA - Systémový lupus erythematodus -SLE oENA – proti extrahovatelným nukleárním antigenům (SS-A, SS-B, Jo1 ….) oProti bazální membráně glomerulů – autoimunitní glomerulonefritidy oProti cyklickým citrulinovaným peptidům – RA oProti tkáňové transglutamináze – celiakie oProti tyrosin fosfatáze, dekarboxyláze kys. Glutamové – DM I oAnti-LC - proti antigenu jaterního cytosolu typu 1 (autoimunitní hepatitidy) oAnti-TTG –proti tkáňové transglutamináza (celiakie) oAnti-TG-tyreoglobulin, anti-TPO-tyreoidální peroxidáza (tyreoitidy) oRF – proti Fc molekule IgG (revmatoidní artritida, Sjogren sy.) oASCA – proti Sacharomyces cerevisiae (Crohnova choroba) – pozor, není to auto-Ab! Hodnocení výsledků oV klinické laboratoři existuje určitá hierarchie hodnocení výsledků oPodílí se na něm laborant i VŠ pracovník oVždy se hodnotí zároveň papírový výsledek s ELISA deskou 1. fáze kontroly – zdravotní laborant o Vizuální kontrola desky –zbarvení o Vizuálně hodnotí, zda se naměřená absorbance (barva jamek) shoduje s výsledky na papíře (pozitivní pacienti – shodují se souřadnice jamek na desce se souřadnicemi v tištěných výsledcích?) ◦ ANO – kontrola pokračuje do další fáze ◦ NE – hledáme příčinu (záměna desky) Hodnocení výsledků Kalibrační řada Blank Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky pacientů Hodnocení výsledků 2. fáze kontroly – VŠ pracovník oVizuální kontrola desky o Není zbarvení celé desky moc tmavé nebo světlé? – uměle zvýšené či snížené naměřené hodnoty vzhledem ke kalibrační křivce o Není v některých jamkách sraženina / nečistota – uměle pozitivní výsledky? oHodnocení s tištěnými výsledky – kontrola kalibrace: o Kontrola průběhu kalibrační křivky o Kontrola jednotlivých bodů – není některý výrazně mimo? o Pozitivní kontrola – leží v rozmezí, které udává výrobce? o Pozitivní vzorek pacienta – souhlasí poloha na desce s papírovým výsledkem? Ideální reálná kalibrační křivka – zploštění u nízkých koncentrací a vysokých koncentrací – koncentrace zkoumaného analytu v séru by měla ležet ve vyznačené přímkovém úseku Hodnocení výsledků oPokud nevyšly kontroly, musí se hledat příčina: o Máme tu správnou desku? Na jakém programu byla změřena? Jaká je šarže kontrol (mohlo nedávno dojít ke změně) oPokud pozitivní kontrola vyšla příliš vysoká/nízká: o Všímáme si rozsahu kalibrace – měla by být co nejširší – od velmi nízkých hodnot absorbance až po vysokou o Zjišťujeme, jak vypadala předchozí měřená kalibrace u minulého zpracování testu o Kontrola pozitivních pacientů se záznamy v LISu (pokud již pacient byl dříve vyšetřen a aktuálně změřený výsledek se shoduje s jeho historií, je pravděpodobně špatně pouze kontrola): o Možná chyba ředění laborantky o Kontrola lahvičky – set, šarže Hodnocení výsledků oVýsledky měření kontrol se dlouhodobě zaznamenávají v čase – interní kontrola kvality o Levey-Jenningsův diagram  Westgardova pravidla o Varovné a regulační meze Stoupající nebo klesající trend může například značit expiraci setu, „zahušťování“ pozitivní kontroly, vadu spektrofotometru…. Hodnocení výsledků oPokud nevyjde kalibrace a kontroly – nutno vyšetření opakovat oPokud je vše v pořádku – VŠ výsledek ELISY podepíše (přebírá za ně odpovědnost) 3. Fáze kontroly o Přepis výsledků ELISA do pracovního listu o Přepisování výsledků z pracovního listu do systému (POZOR na překlepy) 4. Fáze kontroly - VŠ o Ve chvíli, kdy má pacient všechna požadovaná vyšetření hotová, provádí se validace výsledků o VŠ v počítači kontroluje, zda výsledky dávají logický smysl o Seznam výsledků, které je nutno okamžitě hlásit lékaři abnormální hodnoty– VŠ mu vysvětluje, co to znamená – možnost ovlivnění léčby pacienta o Uvolnění výsledků – tzn. propuštění výsledků počítačovým systémem pro tisk Hodnocení výsledků 5. Fáze kontroly – VŠ oZvalidované a uvolněné výsledky pacienta se tisknou v papírové podobě oExpedice výsledků – VŠ, který výsledky uvolnil opět kontroluje tyto výsledky pacienta v papírové podobě  o Není ve výsledcích něco podezřelého? o Nezapomnělo se na žádné vyšetření? oPo expedici výsledků do nich může přes počítačový systém nahlédnou ošetřující lékař dané nemocnice - před tímto krokem mohou výsledky“ vidět pouze pracovníci laboratoře oTištěné výsledky opouštějí pracoviště a putují k ošetřujícímu lékaři Hodnocení výsledků oVŠ svým podpisem odpovídá za výsledky! oO každé fázi zpracování vzorků a kontrol musí existovat záznam – kdo, kdy oRazítka, podpisy oV PC – laboratorní pracovník zapisuje pod svým jménem oVŠ také ovlivňuje laboratorní pracovníky – měl by si všímat nálady na pracovišti, motivovat lidi, aby se nebáli přiznat chybu oJde o zdraví lidí, zatajování chyb nepřichází v úvahu Příklad ELISAACLA - kvantitativně ◦ Výsledky ELISY z readru ◦ Metoda ACLA - protilátky proti kardiolipinu při vyšetření antifosfolipidového syndromu ◦ Výtisk obsahuje: ◦ hodnoty absorbance ◦ musí být uvedeno datum provedení testu ◦ musí být uvedeno, kdo test hodnotil – jméno VŠ ◦ musí být uveden název testu ◦ musí být uvedeno, kdo daný test zpracovával = jméno laborantky ◦ Kalibrační křivka ◦ Dále hodnoty absorbance pro jednotlivé vzorky a přepočet na koncentraci dle kalibrační křivky (není vyobrazeno) Kalibrace Pozitivní k. Negativní k. Výsledky pacientských vzorků Příklad ELISAACLA – kvantitativně, pokračování Výsledek z readeru dále obsahuje: •Naměřené hodnoty absorbancí jednotlivých vzorků, kalibrací a kontrol •Přiřazené hodnoty koncentrací •Označení jednotlivých jamek •Záznam mezí koncentrací ve kterých by se měla pohybovat pozitivní kontrola Sloupec 1 Hodnoty absorbance Sloupec 2 Hodnoty koncentrací Výsledky kontrol Hodnoty kalibrace Označení jednotlivých jamek Příklad ELISAACLA – kvantitativně, pokračování Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: Název testu Datum provedení Kdo zpracoval – jméno laborantky Souřadnice kalibrátorů, kontrol a vzorků pacientů Např. Sérum pacienta č.9 bylo v jamce A9 a zjištění koncentrace ACLA protilátek byla 6 APL/ml Příklad ELISAACLA– kvantitativně, pokračování Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: Kde byl výsledek zpracován Kdo hodnotil Údaje o použité ELISA kitu Vyhodnocení koncentrací pro jednotlivé pacienty Příklad č. 2 LKM autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin Semikvantitativní hodnocení – index pozitivity Výsledky ELISY z readeru ◦ Metoda LKM - autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin při vyšetření autoimunitních hepatitid ◦ Výtisk obsahuje: ◦ Název metody ◦ Jméno laborantky, která metodu zpracovala ◦ Jméno VŠ pracovníka, který hodnotil výsledky ◦ Naměřená surová data (absorbance) kontrol, kalibrátorů a vzorků pacientů ◦ Vypočtené indexy pozitivity na základě poměru absorbací vzorků a kalibrátoru Cut-off kalibrátory Pozitivní k. Negativní k. Výsledky pacientských vzorků Příklad č. 2 LKM autoprotilátky proti mikrozomům jater a ledvin Semikvantitativní hodnocení – index pozitivity Na záznam z ELISA readeru navazuje výsledková listina, kde musí být uvedeno: oKde byl výsledek zpracován oKdo hodnotil oÚdaje o použité ELISA kitu oSouřadnice kontrol a kalibrátorů oVyhodnocení koncentrací pro jednotlivé pacienty Systém vyšetření autoprotilátek oELISA kity velice drahé – cca 10 tisíc oNapř. stanovení ENA – obsáhlá skupina autoprotilátek proti extrahovatelným nukleárním antigenům oVyšetření probíhá ve dvou fázích: 1. screening ENA: je pacient pozitivní na ENA?  ANO / NE 2. Pokud ANO – teprve se nasazuje na ELISU, která určí podtyp ENA (SS-A, SS-B, Jo1, Scl- 70, SM, …) Další metody vyšetření autoprotilátek 1. Imunofluorescence – samostatná přednáška 2. Přístrojová ELISA – analyzátor Alegria 3. Chemiluminiscence – analyzátor Isys 4. Imunoblot Analyzátor Alegria Princip – ELISA na stripech – stanovení autoprotilátek Jamka 1 a 2: prázdné, určené k ředění vzorku Jamka 3 a 4: pokryté antigenem Jamka 5: pozitivní kontrola (obsahuje hledanou autoprotilátku) Jamka 6: křenovou peroxidázou označená anti-lidská IgM/G/A Jamka 7: ředící pufr Jamka 8: TMB substrát (tetra-methyl-benzidin) Stačí pouze odtrhnout alobal z prvních 4 jamek a do první z nich napipetovat pacientovo sérum (10ul)  analyzátor provede ELISU sám Analyzátor Isys oPrincip – chemiluminiscence oPevná fáze – magnetické kuličky oMěření světelné emise která vzniká chemickou reakcí oExtrémní citlivost oSignál úměrný koncentraci auto-Ab ve vzorku oV naší laboratoři: o Stanovení ENA (screening + jednotlivé antigeny) o TTG – IgA a IgG (celiakie) o dsDNA – IgG (SLE) o ACLA – kardiolipin – IgM a IgG (antifosfolipidový syndrom) Magnetická kulička s navázaným antigenem – separace magnetem při promývání Antigen Pacientova autoprotilátka Sekundární protilátka proti lidskému IgG/A/M značená akridinium esterem akridinium ester 3. Při návratu elektronů do základní hladiny - světelná emise  záznam luminometrem 1. Přídavek: Trigger 1: alkalický pufr Trigger 2: H2O2 2. Vlivem oxidace dochází k excitaci akridinium esteru ENA oExtrahovatelné nukleární (jaderné) antigeny oMají vyšší Mr – lze je extrahovat 1) Screening – vytipují se ti pacienti, kteří jsou pozitivní na ENA (obecně) 2) Nasazení pozitivních vzorků na podtypy ENA: o Scl-70 (antigen je DNA topoizomeráza I ) – systémová sklerodermie o Smith (Sm) – pozitivní anti-Sm u části pacientů se SLE (systémový lupus erythematodes) o SSA/SSB – Sjögrenův syndrom o U1-snRNP (ribonukleoprotein učastnící se alternativního sestřihu mRNA) – smíšené onemocnění pojiva o Jo-1 (antigenem je tRNA syntetáza) – polymyositida, dermatomyositida SLE Alterovaná apoptóza – tvoří se autoprotilátky proti antigenům jádra  imunokomplexy  poškození tkání (na obrázku motýlí exantém v obličeji)Systémová sklerodermie Vlivem autoimunitní zánětlivé reakce (Th2 + Th17) se nadměrně tvoří kolagen – sklerotizace pokožky i vnitřních orgánů Sjögrenův syndrom Vlivem autoimunitní zánětlivé reakce dochází k poškození slinných a slzných žláz  suchost očí, suchost v ústech Polymyositida – poškození svalů CD8 T-lymfocyty - bolesti Dermatomyositida – poškození svalových kapilár komplementem  mikroinfartkty svaloviny (klinika- exém nad klouby rukou a fialová vyrážka kolem očí) Smíšené onemocnění pojiva Překryvný syndrom – SLE+RA+systémová sklerodermie+polymyositida Na obrázku Raynaudův fenomén – záchvatovitá bledost prstů – porucha cirkulace Imunoblot oPříprava blotů (probíhá u výrobce): o Proteiny (např. jaderné) elektroforeticky rozděleny v gelu – přenos (otisk) na nitrocelulózovou membránu urychlení elektrickým proudem (elektrobloting) o Membrána je následně rozstříhána na jednotlivé diagnostické proužky o každý protein má na proužku definovanou polohu o Výrobce dodá i šablonu, kde jsou polohy jednotlivých proteinů zobrazeny o Výrobce tyto proužky společně se šablonou prodává laboratořím - kity Imunoblot oPrincip stanovení: o Nejprve se musí zablokovat strip inertní bílkovinou (hovězí albumin) – zabrání se nespecifické vazbě protilátek ze séra na strip! o Pokud je autoprotilátka proti určitému proteinu přítomna v séru pacienta, naváže se na tento protein imobilizovaný na stripu, dochází k imunoprecipitaci o Detekce vazby autoprotilátky pomocí detekčních sekundárních protilátek značených enzymem o Po přídavku substrátu jej enzym přemění na barevný produkt o Výsledkem je vznik barevného proužku na stripu = pozitivita Imunoblot oJednotlivé barevné proužky se porovnávají s kontrolní šablonou oOdečet vizuálně nebo denzitometricky (% pozitivity) oImunoblotem se vyšetřují pacienti, u kterých nebyly detekovány imunofluorescenčně či ELISOU autoprotilátky při přetrvávajících klinických příznacích oDiagnostika – např. roztroušená skleróza Problémy při stanovení autoprotilátek oPři použití různých metodik můžou být někteří pacienti negativní i když onemocněním trpí, např. o Pacient je na určitou autoprotilátku negativní na imunofluorescenci, na ELISE, ale pozitivní na imunoblotu o Nebo o Pacient je pozitivní jen na imunoflurescenci ale negativní na ELISE i imunoblotu PROČ? o Různé metody mají různě ovlivněn cílový antigen (vliv zpracování), na který se autoprotilátka má vázat, např: o Imunofluorescence – použití krysích tkání – antigen se nemusí plně shodovat s lidským – protilátka se nemusí vždy navázat o ELISA – vlivem zpracování antigenů na desku může být ovlivněna struktura antigenu o Imunoblot – vlivem elektroforézy a elektroblotu může dojít k pozměnění konformace molekuly antigenu která vyústí v neschopnost vazby autoprotilátky o Nutnost brát ohled na kliniku pacienta, pokud má typickou symptomatologii ale na určité metodice vyjde negativní, je třeba otestovat autoprotilátky jinou metodikou