beam_vga Optická spektrometrie http://www.pangolin.com absorbance http://www.medgadget.com rev. 2021 Vladan Bernard Biofyzikální ústav, Lékařská fakulta MU Optické metody •Obecně fyzikální laboratorní metody založené na interakci vzorku s elektromagnetickým zářením, či vyzařování elektromagnetického záření vzorkem • •Nespektrální metody – bez výměny energie mezi látkou a zářením, sledovány změny vlastností záření – (rychlost záření, polarizační rovina, rozptyl, ...) • •Spektrální metody – výměna energie mezi látkou a zářením -emisní interakce: detekce záření emitovaného vzorkem (dodáním tepla, elektrické energie, elementárních částic nestabilní energeticky bohaté stavy emise energie) - -absorpční interakce: detekce absorpce záření vzorkem Optická absorpční spektrometrie •Optická absorpční spektrometrie • • -Absorpce elektromagnetického záření vzorkem -Závislost odezvy vzorku na spektrálním složení dopadajícího elektromagnetického záření -Odezva podmíněna strukturou energetických hladin molekul vzorku, vnějším molekulárním pohybem a mezimolekulárními interakcemi -Kvalitativní analýza vzorku dle vyhodnocení průběhu absorpčních spekter a polohy jednotlivých absorpčních maxim (λ) -Kvantitativní analýza vzorku dle „výšky signálu“ absorpčních maxim, hodnoty absorbance • Pole elektromagnetického záření: •superpozice rovinných harmonických vln vektorů pole (složka elektrická a magnetická) •soubor elementárních částic pole – fotony • Charakteristika elektromagnetického záření: • frekvence f • vlnová délka λ • fázová rychlost v (v = λ∙f) • energie fotonu Ep (Ep = h∙f), h- Planckova konstanta • Elektromagnetická vlna u- okamžitá hodnota velikosti vektoru, Um- amplituda vektoru, t- čas šíření, T- perioda, x- vzdálenost od zdroje, λ- vlnová délka • Elementární znalosti středoškolské optiky ??? l2s14 Elementární znalosti středoškolské optiky •Fázová rychlost elektromagnetické vlny v, • •ε- permitivita prostředí, μ- permeabilita prostředí • •Index lomu n, • •v- rychlost světla v daném prostředí • •Zákon odrazu α=α´ •Snellův zákon lomu n1∙sin α =n2∙sin β •Rychlost světla ve vakuu c, c=299 792 458 m∙s-1 • • • •Disperze - index lomu n klesá u normální disperze s • vlnovou délkou dle Cauchyova disperzního vzorce: • • • •Polarizace • • 96591-004-959BC455 http://seismo.berkeley.edu A, B materiálové konstanty • lineární polarizace polcls Polarizace elektromagnetické vlny http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/phyopt/polclas.html pollin • cirkulární polarizace • eliptická polarizace Rotace vektoru elektrického pole a jeho komponenty v ose x a y Polarizace elektromagnetického záření – geometrie kmitů vektorů elektromagnetického pole http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/polarizedlight/waveform3d/index.html • Absorpční spektrometrie •Dělění: elektronová (VIS, UV) absorpční spektrometrie – λ < 1 μm • vibrační (IF) absorpční spektrometrie – nejčastěji λ od 3 μm do 25 μm (celé spektrum 1 μm až 1000 μm ) • •Průchodem elektromagnetické vlny prostředím dochází k snižování její intenzity. •Velikost útlumu monochromatické vlny charakterizuje absorbance A. •Iλo je počáteční hodnota intenzity elmag. vlny, Iλ je velikost intenzity •elmag. vlny po průchodu látkou • •Závislost absorbance Aλ na uražené dráze x elmag. vlny v prostředí popisuje LAMBERTŮV zákon: Aλ= bλ∙x, kde bλ je absorpční (extinkční) koeficient • •Lambertův zákon (LZ) platí pro jednofotonovou absorpci v látkách, u nichž procházející záření nenarušuje původní termodynamickou rovnováhu. Možné odchylky od LZ u biologických materiálů způsobeny např. fotochemickými reakcemi, zvýšením teploty, aktivací chemických reakcí a pod. • •Koncentrační závislost absorpčního koeficintu b popisuje BEERŮV zákon (BZ): b=ε∙c, •kde ε je molární absorpční (extinkční) koeficient, charakterizující absorbující látku. Symbol c zastupuje molární koncentraci roztoku. • •Spojením LZ a BZ: LAMBERT-BEERŮV zákon Aλ= ελ∙x∙c Měření absorpčních spekter – měření propustnosti •Transmitance (propustnost elektromagnetického vlnění vzorkem) • • T: • •Úpravou vztahu pro absorbanci, dostáváme vztah pro T: • • •Relativní transmitance Trel: • •Kde Ivλ je intenzita elmag. vlny vystupující ze vzorku a Irefλ je intenzita elmag. vlny vystupující z čistého rozpouštědla. • Interakce elektromagnetické vlny s prostředím •Energie fotonů se může při interakci s molekulou látky transformovat na energii přechodu elektronu na vyšší energetickou hladinu, na energii přechodu mezi dvěma vibračními stavy či energii přechodu mezi stavy rotačními. • •Absorbující atomy v molekule organické látky se nazývají chromofory • •Oblast IF – dochází při interakci molekul s fotony ke zvýšení jejich vibrační a rotační energie – rotačně vibrační spektra • •Oblast UV, VIS – silná absorpce, v biol. mat. zejména bílkovinami a NK, interakce fotonů elektromagnetického záření s konjugovanými dvojnými vazbami látky • •Oblast mikrovlnného záření - interakce elektromagnetického záření s rotačními přechody molekul vykazujících permanentní dipólový moment E1 E2 schéma přechodu elektronu při absorpci UV nebo VIS záření molekulou Interakce elektromagnetické vlny s prostředím molecular models Infračervená spektrometrie - energie elektromagnetického záření pro tyto vlnové délky (E= h∙f) natolik malá, že nepostačuje při její absorpci na změny elektronových stavů molekul, dostatečná ale na změny rotačních a vibračních stavů molekul - pásové absorpční spektrum - - rotační pohyb – rotace molekuly kolem svého těžiště, detekce u kapalin a tuhých látek obtížná - vibrační pohyb – změna délky vazby a změna vazebného úhlu molecularVibration vibrace valenční vibrace deformační Absorpční spektrometr •Přístroj pro měření spekter propustnosti – absorpční spektrometr • •Část optická: zdroj záření, monochromátor, detektor, vzorková část, optické prvky • •Část elektromechanická: pohyb monochromátoru, měřič signálu detektoru, výstupní a záznamová zařízení • •Spektorfotometr -jednopaprskový (spektrokolorimetr) a dvoupaprskový -statický vzorek (kyveta) X průtočný systém -UV, VIS, IF spektrum Iλ0 Iλ •Zdroj elmag. záření •- tělesa rozžhavená el. proudem (wolframová či uhlíková vlákna žárovek – IR a VIS spektrum, halogenové žárovky – VIS spektrum, Nernstův hořák – žhavená keramická tyčinka světlo o 2-50 μm, deutériová lampa – UV oblast) -výbojky (čárové i spojité spektrum) •Speciální spektroskopické metody využívají také elmag. synchrotronové záření (vznik při pohybu nabité částice, spojité spektrum v UV oblasti) • •Monochromátor •- vstupní štěrbina -disperzní prvek (hranol, mřížka), rozptyl záření dle λ, natáčecí element -výstupní štěrbina (výstup záření o konkrétní λ) - •Detektor záření (podmínky: spektrální citlivost, poměr mezi signálem a šumem, linearita odezvy, časová odezva, ...) -termální detektory (široká spektrální citlivost, dopadající energie elmag. záření způsobuje teplotní změnu detektoru – termočlánek, termistor, bolometr, Golayova cela – změna objemu plynu, pyroelektrický jev – změna rozložení náboje) -polovodičové detektory (fotovoltaický článek, polovodičová fotodioda) -fotoemisní detektory (založeny na vnějším fotoelektrickém jevu, vakuová fotodioda, fotonásobiče) Absorpční spektrometr Fig4 image186 photomult http://cord.org/ Vakuová fotodioda Dopadající fotony způsobují uvolňování elektronů z katody do vakua a jejich dopad na anodu – vznik přepětí ttp://fyzika.jreichl.com/ Fotonásobič Emise elektronů na fotokatodě po dopadu fotonu díky fotoelektrickému jevu, urychlení elektronu elektrickým polem a jeho dopad na dynodu o vysokém kladném potenciálu, sekundární emise elektronů z dynody, ..., dopad elektronů na anodu http://www.astro.gla.ac.uk PhTubes http://sales.hamamatsu.com •Kyvety -dle objemu a „tloušťky“ obsaženého vzorku (V>3ml,V<3ml, mikrokyvety) -dle použitého materiálu (sklo VIS, křemenné sklo UV, chlorid sodný IF, polystyren, ...) •- dle spektrální propustnosti -dle typu vzorků - •Příslušenství -držáky kyvet (cilindrické, mikrokyvety, průtočné kyvety ...) -termostatované kyvety -měniče a podavače kyvet -„Sippery“ - ze software spektrometru řízený systém peristaltické pumpy pro průtočnou kyvetu -modul integrační koule - umožňuje měření sypkých, pastových a zakalených vzorků -kalibrační zdroje -software -záznamová paměť, vstupy a výstupy Absorpční spektrometr z637106 e027781 e033225 220-900 nm spektrální rozsah, 70 μL, analýza DNA, proteiny 3,5 ml, těkavé materiály s10smcom 0,75 ml, mikrokyveta Spektrální transmitance www.sigmaaldrich.com Spektrofotometr jednopaprskový- SPEKOL 11 1- zdroj elmag. Záření 2- kondenzátor 3- zrcadlo 4- vstupní štěrbina 5- kolimátor 6- mřížka monochromátoru (změna λ) 7- kolimátor 8- výstupní štěrbina 9- kolimátor 10- pohyblivý držák kyvet M- měřený vzorek S- srovnávací vzorek 11- vakuová fotonka (detektor) 12- měřič signálu, display 13- zesilovač signálu U-2001 UV/Visible Spectrophotometer spectrometer Dvoupaprskový spektrometr, deuteriový a wolframový zdroj Průchod elektromagnetického záření přes kyvetu s měřeným vzorkem i kyvetu s referenčním vzorkem Praktická laboratorní aplikace F05-15 http://www.siumed.edu Stanovení koncentrací analyzovaných látek a jejich fyziologického stavu dna absorbance spectrum www.bmglabtech.com Absorpční křivky telecí thymové DNA o různé koncentraci Absorpční křivky DNA v závislosti na fyziologickém stavu •UV/Vis absorption spectra of 1.5×10-5 M CFX and different concentrations of DNA (a) 0 M (b) 1.0×10-5 M (c) 2.0×10-5 M (d) 3.0×10-5 M (e) 4.0×10-5 M . Yuejuan Cai et al. ,Frontiers in Bioscience 12, January 1, 2007 fig8 absorption%20spectrum2 Absorpční spektra pigmentů www.faculty.irsc.edu Stanovení neznámé koncentrace roztoku pomocí kalibrační křivky a absorpční spektometrie Neznámá koncentrace x x . / jedn 1) Stanovení vlnové délky pro absorpční maximum 2) Vytvoření kalibrační křivky- závislost hodnoty absorpce na koncentraci roztoku 3) Odečtení hodnoty neznámé koncentrace vzorku Další využití absorpční spektrometrie F%208-11%20Pulse%20oximeter%20sensor Spectrometer in a microplate reader www.medtek.ki.se Image oximetrie testy buněčných kultur, reakčních směsí, roztoků, ... Oximetrie - využívá principu rozdílné absorpce světla molekulou oxyhemoglobinu a deoxyhemoglobinu (max. 660 nm a 920 nm). Pulzní oxymetr měří změny v intenzitě světla dvou vlnových délek během arteriální systoly a diastoly. Hodnoty jsou uváděny v procentech saturace kyslíkem (SpO2 = 100 × oxyhemoglobin / (oxyhemoglobin + deoxyhemoglobin)). Pozor na lakování o rozličné ozdoby nehtů, falešné hodnoty! Testy buněčných kultur, ... - měření absorpce světla ve vzorcích umístěných v jednotlivých jamkách kultivačních destiček (spektrální analýza, koncentrační analýza, ...) Indikátorová diluční metoda metoda pro zjištění průtoku tekutin (zejména krve) pomocí nástřiku barviva a stanovení jeho přítomnosti v čase v průtokové kyvetě – hodnocení minutového srdečního výdeje Pletysmografická Peňázova metoda metoda pro nepřímé měření krevního tlaku. Podstatou metody je průchod elektromagnetického záření prstem vyšetřované osoby. Při tlakové pulsaci krve se mění i objem tkáně a tím i hodnota absorpce. Vhodným tlakem v manžetě jsme schopni kompenzovat systolický a diastolický tlak krve – nulová změna hodnoty absorpce Stanovení bilirubinu v krvi metoda stanovení bilirubinu v krvi založena na absorpci elektromagnetické vlny o vhodné vlnové délce krví, v případě např. sloučeniny azobilirubinu při 570 nm Venózně okluzní objemová pletysmografie metoda sloužící k vyšetření změn prokrvení prstů končetin v závislosti na teplotě prostředí. Provádí se obdobně jako oximetrie, změna toku krve je provázena změnou hodnoty absorpce procházejícího elektromagnetického záření Další využití absorpční spektrometrie Nefelometrie a turbidimetrie •optické metody využívající rozptylu světla heterogenními částicemi v suspenzích a koloidních roztocích •nefelometrie je nejčastěji využívána pro nižší koncentrace rozptýlených částic, detekce intenzity rozptýleného záření nejčastěji ve směru kolmém na vstupující paprsek, využívá Tyndallův jev •turbidimetrie je vhodná pro vyšší koncentrace rozptýlených částic, detektor umístěn v ose paprsku, detekce intenzity záření prošlého disperzním vzorkem a ochuzeného o rozptýlenou složku, stanovení tzv. Turbidance – AT – stupeň zákalu •vhodné metody ke stanovení např. proteinů v séru, znečištění vzduchu a kapalin pevnými částicemi a pod. •Tyndallův jev – při částicích disperzního podílu větších než 5 nm, lze pozorovat rozptyl světla – např. světelný kužel při průchodu světelného paprsku roztokem Nefelometrie a turbidimetrie pracovní schéma turbidimetrie a nefelometrie mereni_rozptylu_svetla Elektronická publikace „Co je co v povrchové a koloidní chemii“, verze 1.0, 2005 Jednotky kalnosti: NTU – nefelometrická jednotka kalnosti, FTU – formazinová jednotka kalnosti (standard), NFU – nefelometrická formazinová jednotka kyveta se vzorkem zdroj AT detektor turbidimetrie detektor nefelometrie Φ0 Φ Φrozptyl Turbidimetrie AT – turbidance, k,α – konstanty, r – střední poloměr částice, l – délka kyvety, c – koncentrace, λ – vlnová délka záření • citlivost turbidimetrie je nepřímo úměrná zvolené vlnové délce, proto je vhodné zvolit co nejkratší vlnové délky zdroje záření – nutnost monochromatičnosti • ve zředěných disperzích (roztocích) je přechod mezi absorpční fotometrií a turbidimetrií neostrý, a proto lze měřenou veličinu AT , jíž odpovídá v absorpční fotometru A u klasické absorpční fotometrie (absorbance), vyjádřit vztahem AT = (e + T).c.l, kde: e - absorpční koeficient, T - turbiditní koeficient, c - koncentrace, l - světelná dráha (tloušťka) měřicí kyvety Nefelometrie •měření intenzity rozptýleného „Tyndallova“ světla na dispergovaných částicích • • • • • •zdrojem světla je nejčastěji halogenová a xenonová výbojka či laser •k měření využívám nefelometrický nástavec fotometru či nefelometr •vlnová délka difúzně rozptýleného záření a záření zdroje je stejná, i když v malém rozsahu dochází na částicích k emisi záření o delší vlnové délce •optimální poměr mezi vlnovou délkou záření monochromatického zdroje a poloměrem částic je 10:1 •příkladem aplikace nefelometrie v přírodních vědách je stanovení jednotlivých plazmatických bílkovin či komplexů antigen-protilátka, čistota ovzduší ... •závislost odezvy nefelometru na koncentraci stanovované bílkoviny je obecně nelineární. Jde většinou o polynom druhého či třetího řádu. V případě vhodně zvolených podmínek je možno závislost aproximovat proložením přímkou. Obecně platí, že linearita měření je tím lepší, čím je koloidní disperze více naředěna nebo je menší velikost částic • laser Nefelometrie a turbidimetrie •Einstein-Debyeova rovnice pro rozptyl světla ... pro zvídavé... Iα je intenzita světla rozptýleného objemovou jednotkou disperzní soustavy pod úhlem θ, I0 celková intenzita dopadajícího (primárního) záření, n index lomu disperzní soustavy, n0 index lomu čistého disperzního prostředí, w hmotnostní koncentrace, M molární hmotnost disperzního podílu, λ vlnová délka primárního i rozptýleného světla, r vzdálenost detektoru, měřícího intenzitu, od zdroje rozptýleného světla α úhel pozorování, tj. úhel sevřený primárním paprskem a paprskem rozptýleného světla, který dopadá do detektoru, F(α) je funkce úhlu pozorování, jejíž tvar závisí na charakteru primárního paprsku (pro vertikálně polarizované primární světlo F(α)=1 , při horizontální polarizaci F(α)=cos2α, pro nepolarizované světlo F(α)=0,5(1+cos2α) , B druhý viriální koeficient - stejný jako u viriálního rozvoje pro vyjádření koncentrační závislosti osmotického tlaku Nefelometrie a turbidimetrie Přenosný turbidimetr (nefelometr) 2100P (Hach) http://www.ekotechnika.com image022 „Přesný dvoudetektorový mikroprocesorem řízený turbidimetr umožňuje skutečnou eliminaci barvy a hodí se i k měření komplikovaných barevných vzorků v terénu. Jeden detektor je umístěn pod úhlem 90° na LED zdroj světla – 860 nm, druhý detektor je přímý... Přístroj měří v automatickém modu v rozsahu 0-1000 FNU ...Kalibrace se provádí na primární formazínové standardy.“ Nephelometer control unit Nephelometer optical unit Nephelometer inlet pipe Nefelometrie a turbidimetrie Nefelometr hodnotící kvalitu ovzduší - řídící jednotka, optické prostředí, venkovní sběrná trubice Sensidyne Nephelometer Real-Time Handheld Dust Monitor Ruční nefelometr pro analýzu obsahu prachových částic v ovzduší. Výrobcem deklarovaná citlivost měření je 1-10,000 μg/m3 s rozlišením až 1 μg/m3 . http://www.zefon.com http://badc.nerc.ac.uk tyndaluv_jev.jpg