HUNI MED Genetika v zubním lékařství - cvičení 1 Ing. Hana Holcova Polanská, Ph.D. Mgr. Lucie Válková Johann Gregor Mendel • 20. 7. 1822, Hynčice t 6. 1. 1884, Brno • Zakladatel genetiky • Objevitel základních zákonů dědičnosti • Zákon o uniformitě Fl generace • Zákon o náhodné segregaci genů do gamet • Zákon o nezávislé kombinovatelnosti alel semeno květ lusk stonek tvar dělohy barva Ivar barva umístění velikost • CO Q šedý S kulatý žluté bílá Plný žlutý lusky a kvěly podél stonku dlouhý É? bílý A svrasklý zelené fialová přiškrcený zelený koncové lusky, vrcholový květ krátký 1 2 3 5 6 7 Pokusy s rostlinnými hybridy (1866) Základní pojmy Genetika • obor zabývající dědičností a variabilitou kvantitativních a kvalitativních znaků všech živých organismů • Gen • základní jednotka dědičnosti (genetické informace) • konkrétní úsek molekuly DNA, který nese informaci pro tvorbu bílkoviny nebo nukleové kyseliny • skládá se z exonů a intronů strukturní funkční |ntror) Exon |ntron | ^ Exon DNA ]>i^gMÄÄ^^>#iiÄÍ'''' Intron Ex0n Intron Exon Intron Exůn Intron Exon Intron Exon Intron Základní pojmy • Chromozom • funkční celek dědičného záznamu genetické informace v buňce • jádro buňky —► 22 párů autozomů + 1 pár gonozomů • Lokus • umístění genu na určitém místě na konkrétním chromozomu • Alela • konkrétní forma genu Chromosome Nucleus Chromatid Chromatid [mage adapted from: National Human Genome Research Institute. Základní pojmy • Genomika • obor genetiky, který se snaží stanovit úplnou genetickou informaci organismu a interpretovat ji v termínech životních pochodů Heterozygot • dvě různé varianty (alely) daného genu nebo jeho části Homozygot • dvě stejné varianty (alely) daného genu nebo jeho části Dominant Recessiv Dominant homozygot homozygot heterozygot B B b b B Základní pojmy • Polymorfismus • existence několika (přinejmenším dvou) alel pro daný gen, z nichž nejméně častá má populační frekvenci alespoň > 1% • Mutace • procesy, při kterých dochází ke změnám v genotypu v důsledku působení různých faktorů prostředí • méně častá alela má populační frekvencí < 1% DNA vs. RNA pentose glycosidic bond OH = ribose H = deoxyribose • molekula DNA = kyselina deoxyribonukleová - Dvoušroubovice - 2 řetězce v opačném směru - Polynukleotidový řetězec • Dusíkatá báze ( T, A, C, G) spojená vodíkovými můstky • Zbytek kyseliny fosforečné • Cukerná složka - deoxyribóza • molekula RNA = kyselina ribonukleová - jednovláknová - Polynukleotidový řetězec • Dusíkatá báze ( U, A, C, G) spojená vodíkovými můstky • Zbytek kyseliny fosforečné • Cukerná složka -ribóza - Typy - mRNA, tRNA, rRNA ■ůí dna DNA RNA qFRNA Oencyri bonu dek Aíid RLbonuckk Acid Ústřední dogma molekulární biologie Jádro Cytoplazma - ribozomy é Replikace v f (syntéza DNA) ) / DNA ■ |ia|H|a ■■■■■■■■■■■■■ Transkripce (syntéza RNA) RNA ■■■■■■I" ■■■■■■■■■■■■■ Translace (syntéza proteinu) PROTEIN aminokyseliny Replikace DNA = tvorba kopií molekul DNA zajištující přenos genetické informace z mateřské do dceřiné buňky • S-fáze buněčného cyklu • semikonzervativní proces - 1 nové + 1 staré vlákno • Složky potřebné pro replikaci • templát - mateřské vlákno • primer - krátký oligonukleotid s volným 3'OH koncem • enzymy • nukleotidy Replikace DNA • Vznik replikační vidlice • helikáza - umožňuje oddálit obě molekuly dvojšroubovice • SSB proteiny - napomáhají udržet vlákna rozdělená • DNA primáza - tvorba RNA primerů • Replikace je zahájena ve specifických místech -počátcích replikace („origins") • DNA polymeráza - katalyzuje prodlužování řetězce • sekvence nového vlákna dle principu komplemetarity bází - adenin + thymin (2 vodíkové můstky) a cytosin + guanin (3 vodíkové můstky) • syntéza od 5' konce ke 3' konci Ofcazakiho fragment Replikace DNA • Templátová vlákna antiparalelní-jeden řetězec opožděn • Vedoucí řetězec - jeden RNA primer na začátku, replikace probíhá bez přerušení • Opožďující se řetězec - ve směru 5'- 3' se diskontinuitné tvoří krátké Okazakiho fragmenty (každý z nového RNA primem), které se následně spojí DNA ligáza • RNA primery jsou odstraněny 5'-3'exonukleázovou a nahrazeny 3'-5'polymerázovou aktivitou lagging strand with Okazaki fragments ding strand 5' 3' 5' 5' 3 Transkripce • přepis informace v podobě sekvence DNA do sekvence RNA • jádro buňky • templát - vlákno DNA • Transkripty se z templátu uvolňují jako jednořetězce • DNA-dependentní RNA polymeráza • 3 typy (strukturně podobné, přepisují různé typy genů) • RNA pol. I (geny kódující rRNA) • RNA pol. II (geny kódující hnRNA) • RNA pol. III (geny kódující tRNA) • vyžaduje přítomnost transkripčních faktorů (rozvolnění řetězců DNA, umístění RNA polymerázy. na promotor a uvolnění z promotoru) • Promotor = startovací místo na DNA - TATA box, CAT box • Terminátor = koncové místo - AAAA Posttranskripční modifikace Modifikace primárních transkriptů: • Připojení čepičky na 5'konec (podílí se na řízení translace mRNA) Obrázek 3 - Strukture \zv. RNA čepičky h2n n x x;> 0 0 0 II II II o-p-o-p-o-p-o 1 I o- o- o oh oh o o 7-methylguanosíne o=p-o o - ch, -o- ^ Ba 0 1 • Připojení polyadenylačního řetězce na 3'konec • Sestřih (splicing) RNA - vystřižení intronů za vzniku zralé mRNA Start of transcription Gm: Intton 1 Eíon 1 I nitron 2 Exon2 Exon3 Transcription Primary transcript Iniron 1 Intron £ Exůňl \/ EtmZ \/EkWi3 Splicing Malure Iranscript: Exonl Exon3E)(On3 Translace • Překlad genetické informace z mRNA do sekvence AMK v polypeptidu (pomocí genetického kódu) • Probíhá na ribozomy v cytoplazmě buňky • Fáze - iniciace, elongace, terminace • Enzym - Aminoacyl-tRNA syntetáza • Iniciační komplex se tvoří na 5'konci mRNA (čepička), zkoumá mRNA od 5'konce a hledá iniciační kodon AUG • Terminace translace: UAA, UAG, UGA • Postranslační úpravy - fosforylace, glykosylace, metylace,.... řetězením aminokyselin vaiiká Lilk /.i id volné amifloky selky. smer posumi nbo™ ^dotiy nboróiu Genetický kód • Systém, podle kterého se přiřazují specifické AMK do polypeptidového řetězce podle sekvence mRNA • Triplet = kodon - definuje AMK nebo terminaci translace • Každá AMK určena jedním nebo několika kodony v mRNA • 64 možných tripletů: 61 určuje AMK, 3 určují terminaci translace • Kodony jsou rozeznávány komplementárními sekvencemi v tRNA (antikodony), které nesou na 3'konci specifické AMK Inzerce/delece jednoho/dvou párů bází mění čtecí rámec (Téměř) univerzální, degenerovaný druhý nukleotid | prvý nukleotid c A G -* -ŕ 3 C ?r to —i K £ fenylalanín A leucín G c CC senn CA CG f^Q tyrozin A A koniec A G koniec G C oysUm G A koniec G G tiypiotán C C £ C leucín C A C G CC CCA proU" CCG CAC his*di" CAA . , . ľ! : ^ qlutamin CAG CG $ ^ arginín CCA CGG C A A A C isoleucín A A A O začiatok AC ACC *7 » treonín ACA ACG AA ^^^.asparagíii AAA AAG ^ 5 serín ACC AGA arginín ACG A G G G C , G A ral,n G G GC 5 alanín G CA G CG G A kys. G A C G A Akys CAG glutamová GG G CC glycín GG A GGC G Genetický kód - změna čtecího rámce A single base-pair delation restores the reading frame changed by a single base-pair addition. DNA ATG TTT CCC AAAGGG TTT.....CCC TAG (Wild-type allele) ^£ £^ CG_5 TTT, C_c£ £AA 000 £T£ Transcription mRNA Single base-pair insertion UGUUU CCC AAA GGG VUU.....COC UAG Translation I' Protein Met - Phm - Pro - Ly* - Gly - Phe Pro-(term) Wild-typt phenotype DNA (Mutant allele) mRNA Suppressor mutation {Single base pair protem deletion) Inserted ■■ base pair alters reading frame. ATG ATT TCC C A A AGG GTT T--TAC TAA, AGG GTT J_C£ CAA A_^_ ^Transcription U G AU U .U C C. CAA. A_G§ G_UIJ Translation Met - lie - Ser - Gin - Arg - Val - CC CTA G G G GAT C CC cu - Lau - Mutant phenotype Altered amino acid sequence Buněčný cyklus MONTAZ MITOTICKÉHO VŘETÉNKA UPLNE BUNEČNÉ UÉLLNS spuštěni anofáse vpustem mechanismu mitoiy fl pcstL|p k c^okin9ZÍ J_ _L / VSTUP DO S spuštění mechanismu replikace DNA REPLIKACE DMA = uspořádaný sled procesů, při kterých buňka zdvojí svůj obsah a následně se rozdělí na dvě buňky dceřiné (každá z nich ponese stejné chromozomy) Cíl: reprodukce genetického materiálu pro příští generaci buněk Buněčný cyklus * Jednobuněčné organismy • sladěno s růstem - mateřská b. musí dorůst do určité velikosti, aby se rozdělila • Mnohobuněčné organismy • sladění replikace DNA s vývojovým programem buňky • sladění replikace a dělení každé buňky s vývojem příslušné tkáně nebo orgánu • dospělost - buňky se dělí, když je potřeba (nahrazení odumírajících buněk, obnova poraněné tkáně) • ztráta kontroly nad buněčným cyklem -> rakovina Buněčný cyklus kladeny vysoké nároky na přesnost • bezchybná replikace • správné řazení fází • mitóza před dokončením replikace -> ztráta genetické informace min. u jedné buňky • dvojnásobná replikace před mitózou -> zvýšený počet kopií genů na příslušné části chromozomu -> nerovnováha v genové expresi, nízká viabilita " přesná segregace chromozomů „ koordinace s vývojovými programy A ^ kontrolní body Buněčný cyklus • řídící elementy - cyklin dependentní kinasy • řídí aktivitu mnoha proteinů zapojených do replikace DNA a mitózy tím, že je ve specifických místech fosforylují (aktivace/inaktivace) • Cyklin + CDK -> komplex se připojí na protein -> fosforylace proteinu -> po fosforylaci se komplex rozpadne a dojde ke změně aktivity proteinu cyclín Cdlc-actiuating Icinase (CAK| Cdk SCtÍV« site activating phosphate {A) INACTIVE IBj PARTLY ACTIVE (C) FULLY ACT3VE Buněčný cyklus - Interfáze Interfáze-Gl, 62,5 • příprava na buněčné dělení, vnější jaderná membrána je spojená s ER * nepříznivé podmínky • setrvání v Gl/vstup do GO; buňky nerostou, mohou tak setrvat i několik měsíců/let G2-fáze • dvojnásobné množství DNA (než v Gl) • syntéza proteinů potřebných na vstup do mitózy \Iikhs Gap 2 S-fáze replikace DNA syntéza proteinů asociovaných s DNA Gap 1 DNA synthesis GO-fáze • většina buněk mnohobuněčných organismů (jsou diferencované a specializované k výkonu určité funkce, nedělí se) • po přijetí prorůstového faktoru mohou vstoupit zpět do buněčného cyklu Gl-fáze • nejdelší a nejvariabilnější • buňka se zvětšuje a zdvojuje organely • na konci této fáze se nachází kontrolní bod: bod restrikce • buňka má dostatek živin a růstových faktorů, vykazuje vysokou metabolickou aktivitu -> přejde bod restrikce a pokračuje do další fáze • nedostatek živin, obdržení antiproliferačního signálu -> zpomalení postupu fází/opuštění cyklu (přechod do GO) Buněčný cyklus - Mitóza jaderné dělení (mitóza) + následné dělení cytoplazmy = cytokineze Mitóza • dělení somatických buněk • vznik - dvě diploidní buňky s identickou genetickou výbavou • profáze - spiralizace vláken DNA, tvorba mitotického vřeténka • prometafáze - rozpad jaderné membrány • metafáze - sestavení kinetochoru na každé centromere, připojení chromatid k vřeténku ( ekvatoriální rovině) • anafáze - separace chromatid k opačným pólům • telofáze - dokončení separace chromatid, rozložení vřeténka, obnovení jaderné membrány Prophase Metaphase Anaphase Cytokinesis Mitóza vs. meióza paihing úf duplicated homologous chromosomes siv alen ts line lipon fr ona replication ) duplicated chromosomes line up individually on the spin ole cell division mzMxi Mitóza = 2 dceřiné buňky s diploidním počtem chromozomů; 1 cyklus DNA replikace, následuje rozdělení chromozomů a jádra (profáze ->• prometafáze -» metafáze -» anafáze -> telofáze) a násl. celé buňky (cytokineze) Meióza = 1 cyklus replikace následován 2 cykly segregace chromozomů a buněčného dělení, vznik haploidních gamet 1. meiotické (redukční) dělení - rozdělení homologních chromozomů; odehrává se zde meiotický crossing-over (rekombinace genů) - žádná z gamet není identická! Poruchy rozestupu - např. trisomie. 2. meiotické dělení - rozestup sesterských chromatid -> 2 dceřiné buňky s haploidním počtem chromozomů, vznik pohlavních buněk (spermie, vajíčko), dodatečné promíchání genetického materiálu crossing-overem gametes Meióza • vznik 4 haploidních gamet (pohlavní buňky) • genetická variabilita Heterotypické dělení • Profáze - 5 částí • Leptotene - spiralizace chromozomů • Zygotene - vznik bivalentů • Pachytene - crossing over = křížení nesesterských chromatid • Diplotene - postupné rozestoupení homologních chromozomů • Diakineze - rozpuštění jaderného obalu, vznik dělícího vřeténka • Metafáze - vzniká ekvatoriální rovina • Anafáze - rozdělení 2n chromozomů, oddálení vřeténka • Telofáze-vytvoření jaderného obalu, zánik vřeténka MEIOZA - heterotypické dělení PROFÁZE Páfy Pomologických chromozomu vznik bivalentu crossing over rozpuštěni jaderné membrány METAFÁZE ANAFÁZE výměna části chromatid TELOFÁZE I vznik dělicího aparálu rozestoupeni chromozomu a icjich redukce z 2n na 1n vznik jaderných membrán dcefmných bunek ft ■C I http://www.szes-la.cz/ Meióza Homeotypické dělení • Profáze - spiralizace chromozomů, vznik dělícího vřeténka, rozpuštění jaderné membrány • Metafáze - vzniká ekvatoriální rovina, připojení na dělící vřeténko • Anafáze - oddalování chromatid rozdělených chromozomů • Telofáze - vytvoření jaderné membrány, zánik dělícího vřeténka, despirilizace chromozomů MEIOZA - homeotypické dělení http://www.szes-la.cz/ Mutace Mutace jsou dědičné změny na úrovni genetického materiálu, které se projevují ve změně primární struktury nukleové kyseliny, tj. změně v sekvenci nukleotidů. Souvisí se změnou genotypu, ale nemusí se projevit i fenotypově. • Význam mutací: • Pozitivní - zdroj dědičné variability, význam pro evoluci • Negativní - hromadění vadných genů, vznik geneticky podmíněných onemocnění, tvorba nádorů • Neutrální • Klasifikace mutací: • spontánní (chyby při replikaci) x indukované (mutageny) • gametické x somatické • dominantní x recesivní (1:100) • přímé x zpětné (mutovaný genotyp se zpětně mění na původní genotyp) • vitální x letální •jaderné x mimojaderné (mt, cp) • genové x chromozómové (strukturní CHA) x genomové (numerické CHA, aneuploidie, Polyploidie) Genové mutace Genové (bodové) mutace • substituce bazí (tranzice, transverze) - standardní alela -> mutantní alela -> změněný protein • delece/inzerce bazí (změna čtecího rámce) • Důsledky bodových mutací: • mutace měnící smysl kodonu (jiná AMK) • nesmyslné mutace (stop kodon) • silent mutace (jiný kodon, stejná AMK) • Srpkovitá anémie - AR dědičnost; substituce CTC -> CAC v beta řetězci (záměna kys. glutamové za valin); rezistence vůči malárii (infekci plazmodiem) - heterozygotní výhoda (selekční výhoda oproti oběma homozygotům) Núonůlnl | C a T g T a _i-1-1_ g t g GAG -1—1-^-1— C a t ; T Ä C C — t —r— G -r-T — a C ^— G i : a; G t a | a := T G ■ a C a T G G t ; Substituce C a T : G i C i a C 1 c T i G i T i a i C C l i a : G T A j C G T G G C A —i— T —^ G G l : T a CC a Q A t G! G T C c T c T C C C l (i T A C c: T 0 A & T G G A C A 1 G G o. Chromozómové mutace Strukturní chromozómové aberace jsou důsledkem jednoho nebo několika zlomů v DNA. Klasifikace: • balancované (zachováno původní množství genetického materiálu) • translokace - např. Philadelfský chromozom t(9;22) u CML • inverze • inzerce • nebalancované (část genetického materiálu chybí či přebývá) • duplikace • delece •Cri du chat (delece na krátkém raménku chr. 5) • Prader-Willyho syndrom (delece paternálního chr. 15) •Angelmanův syndrom (delece maternálního chr. 15) • izochromozom • ring chromozom 21 46,XX,del(5)(pl4.1) f v ,1,. Genomové mutace * Aneuploidie pohlavních chromozomi • Turnérův syndrom 45, X • Klinefelterův syndrom 47, XXY • XXX syndrom • XYY syndrom *Aneuploidie somatických chromozorr • Downův syndrom (21) • Edwardsův syndrom (18) • Patauův syndrom (13) * Polyploidie • mezi obratlovci vzácná, častější u rostlin ••v / 1 11 1 Karyotype from a female with Patau syndrome (47,XX,+13) : § II ■ t It 1 2 3 4 5 " 1 -:, ! o» - - a 6 7 8 9 10 11 • - (f \ ■ » 13 14 15 16 17 18 ■ : • - f ■ : ( 0: 19 20 21 22 > S.XXY 12 Mt II it II 1 2 3 4 5 >l)( 11 )! ü !! ){ S 9 10 11 12 13 1^14 ,S K :5 il 16 17 18 i« j: i** 21 22 *X Y IS sfi ii Normální karyotyp iir in ni Iii Triploidie — S! Hin Trizomie Monozomie V Aneuploidie DNA diagnostika Detekce přítomnosti nukleové kyseliny specifické sekvence • Identifikace živočišného druhu • Paternita • Identifikace jedince - forenzní účely • Profil DNA-SNPs • Analýza struktury (sekvence) nukleové kyseliny • Stanovení genotypu • Detekce klinicky významných mutací a polymorfismů • Dědičné choroby • Detekce v onkogenech a supresorových genech v nádorech Prenatální, preimplantační diagnostika Kvantifikace nukleové kyseliny se specifickou sekvencí • Hodnocení intenzity a změny exprese genů - tumory Kvantifikace proteinů a typů jejich posttranslační modifikace fľ I Metody molekulární biologie • Vstupní biologický materiál - Plná krev - sérum nebo plazma - Sliny - Buňky - Tkáně - Tělní tekutiny • Izolace DNA, RNA, proteinů ze vstupního materiálu • Molekulární a biochemické metodiky pro stanovení dané problematiky - Detekce polymorfismu • PCR-RFLP-detekce na ELFO • Real time PCR • Sekvenace PCR - Polymerase Chain Reaction • Cíl - získání požadované a specifické sekvence genomové DNA bez jejího předchozího klonování • Princip - mnohonásobná replikace • cca 30 cyklů • závislost na teplotě reakční směsi • množství namnožené DNA roste exponenciální řadou (2n) TermOCyCler —■ lstcyde —► 2ndcyclc —> 3rdcyck —► 4th cycle----------> 30thcyclc 2*' = 2 billion copies Exponential Amplification Process is repeated, and the region of interest is amplified exponentially Gelová elektroforéza separační metoda princip - pohyb nabitých molekul ve stejnosměrném elektrickém poli (separace molekul o rozdílné molekulové hmotnosti) rychlost pohybu je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku DNA má uniformní negativní náboj —► v elektrickém poli se pohybuje od katody k anodě části aparatury • elektroforetická vana • separační gel • pufr • zdroj stejnosměrného elektrického proudu agarózová (produkt mořských řas - agar)/polyakrylamidova EtBr - vmezeří se mezi báze, zviditelní DNA pod UV POWER SUPPLY ELECTROPHORETIC BUFFER CATHODE SAMPLE HIGH MOLECULAR WEIGHT SPECIES ANODE ANODE LOW MOLECULAR WE IGHT AMALYT ES https://www.sciencedirectxom/topics/criemistrv/aEarose-Eel-electroprioresis PCR + ELFO video Sekvenace DNA stanovení primární struktury DNA (pořadí nukleotidů) chemická metoda - degradace řetězců nukleových kyselin pomocí chemických činidel (dimethylsulfát, NaOH, hydrazin,..) enzymatická metoda - specifická inhibice enzymové syntézy DNA Produkt - řetězce ssDNA, jejichž vzájemná velikost se liší o jednu bázi Vstupní materiál - fragment DNA s jedním definovaným koncem Sekvenace DNA - video Western blot - video Western blot je metoda používaná k detekci přítomnosti specifického proteinu ve vzorku. Touto metodou je možné porovnat množství proteinu v různých vzorcích. Western blot patří mezi imunochemické metody, které mají využití v klinické diagnostice i ve vývoji léků. Laboratoř TK - video In vitro experimenty se využívají v biologii, medicíně a dalších příbuzných oborech a jsou založeny na pěstování buněčných/tkáňových kultur mimo organismus, ze kterého pochází. Laboratoř TK - video Doporučená literatura pro samostudium Děkuj za pozornost