u r j i ED Genetika v zubním lékařství - cvičení 2 Metody molekulární biologie Ing. Hana Holcova Polanská, Ph.D. Mgr. Lucie Válková Biologický materiál Biologický materiál je vše, co bylo či je součástí nebo produktem živého organismu. - sušená bylinná čajová směs - ohryzek od jablka - dubové prkno - kočičí trus/srst - zkumavka s virem SARS-CoV-2 - tělní tekutiny - moč, krev, plazma, sérum, sliny, ejakulát, hlen - tkáně, buňky Izolace nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu - v dostatečném množství a požadované čistotě. N K je potřeba zbavit všech všech látek,které se po lyži buněk stávají součástí hrubého lyzátu a jejich přítomnost by bránila účinnému specifickému působení enzymů používaných k dalším analýzám. Homegenizalion Lysis Separalion Izolace genomové DNA Izolace RNA-důraz na ochranu před degradací! Precipitation Homogeniiation/ Lysis Phase Separation Extraction/ Precipitation Resu sponsion PCR - Polymerase Chain Reaction • Cíl - získání požadované a specifické sekvence genomové DNA bez jejího předchozího klonování • Princip - mnohonásobná replikace • 25 až 35 cyklů • závislost na teplotě reakční směsi • množství namnožené DNA roste exponenciální řadou (2n) • Termocycler PCR Protocol Get the reagents Prepare the mix Set up conditions Analyze the gel Negative result Cry fiSKeWiirujScitwe PCR • Mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce • Řetězová reakce vycházející z DNA replikace • Opakování cyklů: - denaturace (separace dsDNA) - 96 °C - annealing - navázání primerů - 50-65 °C - elongace - syntéza nového vlákna DNA - 72 °C Denature DNA sample lo separate DNA strands (94°C. 5 min) Primers bind to DNA Strands {30-ó5eC, 30 s) Denature to separate DNA strands (94°C, 30 s) Polymerase synthesizes new DNA strands (72°C, 45 s-2 min) Region of ^r"5' 'I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 interest ................... |98°C 5' II 1 II 1 II t II I II I II I H i I I I I y 1 i li i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 » I 48 to 72°C y5' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I y Template DNA Strands 5 r Primer ^, Primer Denaturation Temperature is increased to separate DNA straaids Annealing Tempi: rulu re is decreased to allow primers to base pair to complementary li t Iii n n n i n.......s g*»5£ I ŔS to 72°C ^ V5 I I I I iľl iľlffl i II I II I II I II 3' Extension F- - • •.J.lJJLillIII FI „ i_________ Nascent' DNA strands I I I I I I I ľ-ff r ' i i i'iľi in.. ' ,1,1,1,1,1,1,1 i i i Ti £U, 1,1,1,1,1 ■ Polymerase extends primer to form nascent DNA strand 1st cycle .....HI....... 2nd cycle rfrfiTiTrrfiTrrmT 2J = 4 copies Trrnrrr .,,,„„, IIIIII! 1 ........ i::: ■ 1 Illlllll yy.Y.V: ■i i n 3rd cycle - ........II 23 = 8 copies 24 = 16 copies 4th cycle----------► 30th cycle 2J1 = 2 billion copies ■!! ! .Ľ_L Ulli :| 1 1 :| i íl ::: :| : :i :i i n 'i II!1! :| ■ 11 !| ! II II i i! ■! :| '1 H M M1 ILiUli JTH1ÜLU1 Exponent La L Amplification Process is repeated, and the region of interest is amplified exponentially 25 = 32 copies PCR DNA replikace - in vitro (PCR) • templátová DNA % • dNTP TlTTTTn ^ • pufr(pH=8) • Mg2+ ionty tttttti "5^*5^ Toq DNA • Ovlivňují aktivitu a přesnost polymerázy primer • krátké specifické úseky DNA • oligonukleotid 20-25 pb • ohraničení oblasti amplifikace DNA DNA polymeráza • termostabilní (odolává teplotám až 98 °C) • Taq [Thermus aquaticus), Tth [Thermus thermophilus) teplota DNA replikace - in vivo • enzymy - helikáza, primáza, DNA polymeráza, ligáza ... DNA replication □ NA polymerase C) Vyžaduje radioaktivní značení na jednom konci ssDNA. Reakce je prováděna ve 4 zkumavkách - v každé zkumavce jsou štěpeny pouze určité typy bazí. Vzniká směs různě dlouhých fragmentů končících v místě určité báze -> vyhodnocení pomocí elfo, stanovena sekvence daného úseku. i i i i i i i i i G>A A>G T+C G>A A>G T+C 1 I I 1 I I 1 I I ACAATGCGT Single stranded DNA template Cleave at specific bases C - Separate by gel electrophoresis and detect labels T G C G T A A C A Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v= B5DJ8PL4E0 Sangerovo sekvenování Enzymová metoda Založeno na principu replikace - ukončení syntézy DNA v okamžiku, kdy se ddNTP zařadí na místo dNTP ddNTP = analog dNTP, ale postrádá hydroxylovou skupinu na 3' pozici uhlíku ddNTP - koncové terminátory Reakční směs (4x) • DNAtemplát • primer • ddNTP-v nízké koncentraci • dNTP - v nadbytku (aby bylo možné získat fragmenty všech možných délek) • Taq DNA polymeráza - syntéze DNA od 5' ke 3' konci • pufr Vyhodnocení - elektroforéza Modifikace -> fluorescenčně značené ddNTP (4 různé barevné značky) - reakce provedena v jedné zkumavce 7 7 -t -i -i ■) 7 v 7 DNA to be sequenced TGGTCGACGA I I Z I 3 I 4 I $ I 6. I 7 I S f 3 I ÍO Video pro názornost: https://www.voutube.com/watch?v=wdS3iOTgbiM Sangerovo sekvenování Kapilární sekvenace DNA s fluorescenčně značenými ddNTP © Reaction mixture ► Primer and DNA template ► DNA polymerase ► cWNTPs with flourochromes ► dNTPs (dATP, dCTP, dQTP, and dTTP) _ Primer f I I.....II 3 "..................- 5T 5--T B-r S-r Tem piste _ r ddNTPa ddTTP-ddCTP-# ddATP-# ddGTP ® Primer elongation and chain termination +3 1-, 3" TTT. 3- J I J 1*3- ® Capillary gel electrophoresis separation of DNA fragments □doctor 8> Laser detection of flourochromes and computational sequence analysis Chromatograph NGS - Next Generation Sequencing Sekvenování tisíců až milionů sekvencí současně Templátová DNA je fragmentována na úseky několik set bp dlouhé Konce fragmentů jsou enzymaticky zatupeny a napojeny k oligont určité sekvence (= adaptéry) Jednotlivé fragmenty jsou odděleně amplifikovány PCR a v dalším kroku paralelně sekvenovány Fragmented input □NA Ena Repa dA Tailing Adaptor Ligation íizeSelectlon Amplification Hex! Gene ration Sequencing Využití: - celogenomové sekvenování - sekvenování chromozomů, plazmidů, mt - studium genetické variability mutační analýza - transkriptomová analýza Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=shoie 9IYWc Praktická část cvičení Praktické provedení PCR Objem v mikrozkumavce: 25qL Složení (1 vzorek): • templátová DNA (2qL) • 2 primery (1.25 ql_) • MgCI2 25mM (4 ql_) • dNTP mix (0.5 ql_) • Taq polymeráza 1U (1 ql_) • pufr (2.5 ql_) • PCR H20 (12.5 ql_) o o 1 kapka minerálního oleje 1. 95°C.....5minut 2. 95°C.....1 minuta 3. 60°C.....lminuta 4. 72°C.....lminuta 5. 72°C.....7minut 6. 10°C.....lOminut ELFO 2. ELFO restrikčních fragmentů po štěpení Taql (nerozštěpený = polymorfismus) ELFO - praktické provedení 1. Připravit nalévací misku + hřebínky. 2. Připravit gel (2%): navážit agarózu a přenést do Erlenmayerovy baňky přidat lx TBE pufr (200 ml) 3. Zvážit a v mikrovlnce přivést k varu. 4. Po zchladnutí na cca 40 °C přidat EtBr (1 ul / 10 ml). 5. Nechat gel ztuhnout (cca 30 min). 6. Odstranit hřebínky a gel vložit do elektroforetické vany s lxTBE pufrem (elektrolyt). 7. Připravit kapky nanášecí barvy na parafínový papír a smíchat s vzorky DNA. 8. Vzorky nanést do jamek. 9. Zapojit do zdroje elektrického napětí. 10. Sledovat postup DNA gelem (20min). 11. Vizualizace pod UV a vyhodnocení. Práce s mikropipetou J Mikropipeta 1 - dvoupolohový ovladač 2 - držák 3 - jednorázová špička • Pipetu držím vždy vertikálně (špičkou dolů). • Pipetu držím v dlani zavěšenou za ukazováček a ovládám ji palcem. • Vyberu optimální rozsah objemu!!! Nikdy neprekračujú rozsah pipety nahoru ani dolů!!! • Před pipetováním musíme na pipetu nasadit příslušnou špičku (dle objemového rozsahu pipety). • Vždy používám novou sterilní špičku. • Pokud opakovaně pipetuju tentýž roztok, ponechám na pipetě po celou dobu práce tutéž špičku. • K odhazování špiček slouží tlačítko na boční straně pipety. Práce s mikropipetou Postup: • Na pipetě nastavím požadovaný objem. Vodorovná čára na displeji značí desetinnou čárku. • Nasadím špičku na pipetu (důkladně utěsním) - ne rukama! • Pipetu uchopím tak, abych si o ukazováček podepřel/a držák a palcem tak mohl/a pracovat s dvoupolohovým ovladačem. • Nasátí: ovladač stlačím do polohy „1" (špička je ve vzduchu), ponořím do roztoku a pomalu pustím. • Vypuštění: pipetu ponořím do roztoku, kam chci pipetovanou látku přidat. Vypustím roztok stlačením ovladače do polohy „1" dokončím stlačením do polohy „2" a vyjmutím špičky z roztoku (stále v poloze „2"). • Ovladač pustím, špičku vyhodím. Obr. 3.2.2: Polohv ovladače: Děkujeme za pozornost