Vyšetření funkce
komplementu
Mgr. Julie Štíchová
FN u Sv. Anny v Brně
Komplement
oObjev – Jules Bordet – termolabilní substance v plazmě
oSložka nespecifické humorální imunity
oSystém několika desítek proteinů, většina tvořena
v játrech
oVelmi rychlá aktivace
oSilné zánětotvorné a lytické účinky
Komplementový systém tvoří:
• Centrální proteiny C1-C9
• Komplementové receptory na buňkách
• Stabilizátory komplementu
• Inhibitory komplementu
• Solubilní
• Membránově vázané
Komplement - funkce
oAktivovaný komplement podporuje:
o Rozvoj zánětlivé reakce (anafylatoxiny – C3a, C4a, C5a)
o Opsonizace (C3b, C4b)
o Chemotaxe (C3a, C5a, komplex C5,6,7)
o Lýza buněčných membrán (C5b-C9 – MAC)
o Imunokomplexy s C3dg – přemostění CD21 (komplementový
receptor 2 – CR2) a BCR na B lymfocytech – zesílení signalizace,
podpora diferenciace do plazmatických buněk
Komplement - funkce
oOdstraňování imunokomplexů z cirkulace (C3b)  vazba na CD35 (CR1) na RBC 
zabránění tvorby velkých imunokomplexů likvidace ve slezině/játrech
oNapomáhá odstraňování apoptotických tělísek makrofágy (opsonizace)
RBC
Makrofág
Zdroj: Janeway Immunobiology 8th edition
Regulace komplementu
oAktivovaný komplement má amplifikační potenciál, nutná důsledná regulace
1) Regulátory pozitivní:
o Properdin (faktor P) – stabilizace alternativní C3 konvertázy
2) Regulátory negativní
a) Solubilní:
◦ C1 inhbitor (C1INH)
◦ Faktor H
◦ Faktor I
b) Membránově vázané:
◦ Decay accelerating factor – DAF (CD55)
◦ Membrane cofactor protein – MCP (CD46)
◦ Protektin (CD59)
Komplement – přehled laboratorních testů
1. Kvantitativní testy
Stanovení koncentrace složek
komplementu
2. Funkční testy
stanovení funkce komplementové
kaskády nebo inhibitorů
1. Kvantitativní stanovení
oVyjádření výsledků – koncentrace g/l, mg/l
1) Nefelometrie – složky C3, C4, C1Q, C1-INH, MBL
2) ELISA
3) Radiální imunodifuze (RID)
◦ Stanovení C2 a C5 složky komplementu
◦ V gelu protilátka proti C2 nebo C5
◦ Sérum pacienta difunduje do gelu
◦ V zóně ekvivalence se vytvoří precipitační prstenec
◦ Čím vyšší koncentrace C2/C5, tím větší průměr prstence
Komplement – normální hodnoty
oC1q (100-250mg/l)
oC2 (10 – 30 mg/l)
oC3 (0,7 – 1,5 g/l)
oC4 (0,1 – 0,4 g/l)
oC5 (80 – 170 mg/l)
oMBL (> 0,3mg/l)
oC1 inhibitor (210 – 390 mg/l)
2. Funkční vyšetření - odběry
oNěkteré složky komplementu jsou termolabilní, proto:
oSpeciální odběrové zkumavky bez separátorů
oVyvarovat se teplotním šokům při transportu
oZpracovat krev do 60 min od odběru
oSérum zamrazit (-20 °C max. týden, -70 °C libovolně dlouho beze ztráty aktivity)
oSérum po rozmrazení nesmí být opětovně zamraženo
Hemolytický test CH50
oScreeningová metoda
oZjištění funkčnosti klasické cesty aktivace komplementu  formace MAC
oZájem o sníženou funkci komplementu
oVýsledky se vyjadřují v % aktivace
oSérum nutno zpracovat do 1 h od odběru
oProč CH50?  jednotka CD50
Množství séra, které za standardních podmínek způsobí 50% lýzu definované suspenze
beraních erytrocytů – 30min, 37 stupňů
CH50
Reagencie:
1) 5% suspenze beraních erytrocytů
◦ (Příprava: Beraní krev 3 krát proprat fyziologickým roztokem, naředit na 5%)
2) Amboceptor – králičí protilátka IgM proti beraním RBC
◦ (Příprava: rozpustit lyofylizovaný prášek od výrobce v 1 ml destilované vody, poté naředit v poměru 1:1001 ve fyziologickém
roztoku, např. 2 ul amboceptoru + 2 ml fyziol. Roztoku)
Příprava hemolytického systému
Do 5% suspenze RBC přidejte stejné množství amboceptoru (ne naopak!)
Inkubace 15-30 min v lednici
CH50
Krok 2:
Nařeďte kontrolu a pacienta ve dvou ředěních:
Kontrola Pacient
1:40 1:401:60 1:60
Ředění 1:40
25 ul séra + 975 ul fyziol.
roztoku
Ředění 1:60
15 ul séra + 885 ul fyziol.
roztoku
CH50
Krok 3: Příprava ředění
Světle modrá barva:
100 ul fyziologického roztoku
Tmavě modrá barva
100 ul destil. vody
CH50
100 ul sér v ředění 1:40
KONTROLA PACIENT
100 ul sér v ředění 1:60
CH50
ODPAD
ODPAD
CH50
Krok 4: Do všech jamek přidejte 100 ul hemolytického systému
(konečný objem ve všech jamkách - 200 ul)
Krok 5: Inkubace 60 min v termostatu
Krok 6: Centrifugace 5 min/2000 ot./min
CH50
Krok 7: Po centrifugaci přeneste 100 ul supernatantu z každé jamky do nové (sloupec 5-8)
Pozor, nesmí se nabrat pelet na dně jamek!
Krok 8: Měření absorbance na ELISA
readeru - program CH50
CH50 - vyhodnocení
Jamka s fyziologickým roztokem = blank - 0% hemolýza (pozice 6H, 8H)
Jamka s destilovanou vodou = 100% hemolýza (pozice 5H, 7H)
1) Z dubletů spočítat průměr absorbance pro každé ředění
2) Z průměrné absorbance (A) spočítat % lýzy pro každé ředění dle vzorce:
𝐀 𝐝𝐚𝐧é𝐡𝐨 ř𝐞𝐝ě𝐧í − 𝐀 𝐛𝐥𝐚𝐧𝐤𝐮
𝐀 𝟏𝟎𝟎% 𝐥ý𝐳𝐲 − 𝐀 𝐛𝐥𝐚𝐧𝐤𝐮
× 𝟏𝟎𝟎 = % 𝑙ý𝑧𝑦 𝑝𝑟𝑜 𝑑𝑎𝑛é ř𝑒𝑑ě𝑛í
CH50 - hodnocení
3) Sestrojit graf – závislost procenta lýzy na ředění (kontrola i pacient) – 1 graf
Odečíst ředění při 50% lýze  je aktivita komplementu u pacienta srovnatelná nebo
nižší v porovnání s kontrolou?
CH50 - souhrn
oZjištění funkčnosti klasické (CH50) nebo alternativní (AH50) cesty komplementu
oProjeví se lýzou definované suspenze RBC  nárůst absorbance supernatantu v
důsledku uvolnění hemoglobinu
oVýsledky se vyjadřují v % aktivace
oPozor – se vzorkem pacienta nutno zpracovat i zdravou kontrolu, aby bylo pacienta s čím
srovnat (u tohoto testu nejsou dány přesné referenční meze)
Alternativy CH50 - ELISA
oV některých laboratořích CH50/AH50 nahrazeno ELISA metodou
o Princip – na dně jamky aktivátor určité cesty komplementu  detekce neoepitopu při formaci
membranolytického komplexu
Klasická cesta Lektinová cesta Alternativní cesta
C1-INH funkční test
oSérum nebo plazma se inkubuje s reaktantem - aktivovanou exogenní složkou C1s (je
součástí setu), která je vazebným místem pro C1 INH
oPokud je C1 INH funkční, naváže se na C1s
oNásleduje odmytí nenavázaných složek
o Do jamky se následně přidá konjugát - kozí protilátka proti lidskému C1 INH - značená
křenovou peroxidázou (přeměna substrátu na barevný produkt)
oSpektofotometrie - určí množství navázaného C1-INH
oNefunkční C1 INH – ke zbarvení nedojde, protože se
neutvořily detekovatelné komplexy C1s-C1INH
Indikace k vyšetření komplementu
oPodezření na funkční deficit komplementu
o Testuje se CH50/AH50  v případě nalezení patologie se stanoví koncentrace jednotlivých
složek
oMonitorování zánětu
o Složky komplementu se chovají jako pozitivní reaktanty akutní fáze – ↑↑ koncentrace
oMonitorování imunokomplexových chorob
o Silná aktivace komplementu – dochází ke konzumpci jeho složek – ↓↓ koncentrace
oPodezření na poruchu regulátorů komplementu – C1 inhibitor + složky C3 a C4
Deficience složek komplementu
oDeficience C1–C4 (podílí se na odstraňování imunokomplexů)
oČastý výskyt imunokomplexových chorob (SLE-like)
oNáchylnost k pyogenním infekcím
oDeficience C5-C9
◦ Náchylnost k pyogenním infekcím
◦ Opakované infekce Neisseria meningitidis
o Deficience MBL – častější infekce u dětí
Deficience složek komplementu
oDeficit C1-inhibitoru – Hereditální angioedém
oDeficit membránových inhibitorů CD55 a CD59 – Paroxysmální noční hemoglobinurie (PNH)
oDeficit sérových inhibitorů faktor H a faktor I – atypický hemolyticko-uremický syndrom (aHUS)
Když ochrana chybí…
oMutace genu pro GPI kotvu v hematopoetické kmenové buňce  na povrchu BRC
dochází k deficitu proteinů, které jsou normálně pomocí GPI kotvy vázány
o DAF (CD55) – inhibice aktivace C3 a C5
o Protektin (CD59) – inhibice aktivity MAC (C5b-C6-C7-C8-C9)
oRBC citlivé ke stopovým množstvím aktivovaného komplementu - hemolýza
Paroxyzmální noční hemoglobinurie
Hereditální angioedém
oZpůsoben deficitem C1 inhibitoru (C1 INH) – který inhibuje serinové proteázy C1r, C1s (ireverzibilní
vazba – C1 INH se spotřebovává)
oDůsledek:
1) Aktivace klasické cesty komplementu – konzumpce složek, zejména C2 a C4 (provokující
faktory – menstruace, stres, zubní zákroky….)
2) Nedostatečná regulace kininového systému (C1 INH
inhibuje také kalikrein)
Mechanismus:
C1 INH není schopen dostatečně tlumit přeměnu prekalikreinu
na kalikrein 
Kalikrein štěpí vysokomolekulární kininogen na bradykinin 
ten se váže na bradykyninové receptory na endoteliích 
vazodilatace, zvýšená permeabilita cév (lokálně) 
vznik nezánětlivého edému
Hereditální angioedém
Klinický obraz:
oEpizodické otoky, edémy – podkoží, pod sliznicí
oBledá barva otoků, nesvědivé, bez lokální zvýšené teploty
oMohou být bolestivé – napětí ve tkáních
oVětšinou se vyvíjejí postupně, během 12-36h
oOtoky nereagují na antihistaminika, nedostatečně na
kortikosteroidy
oKlinické obtíže značně variabilní – dle výskytu otoku
oOtok v oblasti krku – nebezpečný – hrozí udušení
oOtok v oblasti břicha – připomíná akutní příhodu břišní
oÚtlak močových cest, střeva  retence moči, střevní neprůchodnost
Hereditální angioedém
Typ 1: porucha tvorby C1INH, 85% nemocných
◦ Snížení C1INH na 12-50%, C3 v normě, snížené C2 a C4
Typ 2: Funkční porucha C1INH
◦ C1INH může být snížený, v normě i zvýšený, ale je funkčně
neaktivní, snížené C2 a C4
Typ 3: estrogen dependentní – mutace FXII
• Bez abnormalit v množství a funkčnosti C1 INH
Pozn.
Existuje také získaný angioedém, na který je třeba v diferenciální diagnostice myslet – snížení C1q
1) Zvýšený katabolismus C1 INH – některá lymfoproliferativní onemocnění
2) Autoimunitní onemocnění – tvorba autoprotilátek, které blokují aktivní místo C1 INH  ztráta funkce
Vyšetření u hereditálního angioedému (HAE)
oScreeningový test HAE: vyšetření C4 složky  pokud je snížená následuje:
oVyšetření koncentrace a funkce C1 INH
oStanovení dalších složek komplementu: C2, C3, C5
oVyloučení získaného angioedému: stanovení C1q
oPotvrzení diagnózy pro HAE typ I a II: Genetické vyšetření – mutace v genu pro C1 INH
Léčba HAE
oSnaha minimalizovat stresující faktory, které indukují edémy
o Omezení sportu
o Volba vhodného povolání
3 strategie léčebné terapie:
1. Dlouhodobá profylaxe – mimo ataku
2. Krátkodobá profylaxe – prevence vzniku edému během zákroků
3. Léčba akutní ataky
Léčba HAE
1. Dlouhodobá profylaxe
o Atenuované androgeny – zvyšují syntézu C1 INH v játrech (nesmí se podávat dětem a
těhotným ženám, zvážení užití u žen ve fertilním věku negativní vedlejší účinky - viritizace)
o Kyselina tranexamová – inhibuje plazmin, čímž se „šetří“ C1 INH
o Koncentrát C1 INH – u lidí, kde výše zmíněné léky nelze podávat nebo u závažných forem
HAE
2. Krátkodobá profylaxe – snaha zabránit vzniku edému během operací, endoskopií a
zubních extrakcí
o Koncentrát C1 INH
3. Léčba akutní ataky
o Koncentrát C1 INH – derivát z plazmy nebo rekombinantní
o Icatibant – kompetitivní antagonista bradykininových B2 receptorů – kompetice o vazbu s
bradykininem