Mgr. Zuzana Strašilová
Krevní barviva – porfyriny,
hemoglobin, bilirubin
Porfyriny
Porfyriny
 prekurzory hemu
 tetrapyrolové jádro (porfin)
 substiuenty (methyl, vinyl, acetyl, propionyl aj.)
 metaloporfyriny (Fe, Mg, Co, Pb)
 Podle počtu karboxylových skupin rozlišujeme
okta (8, uroporfyrin), hepta (7), hexa (6), penta (5),
tetra (4, koproporfyrin) porfyrin
Porfyriny
 Porfyriny - tetrapyroly, prekurzory hemu
 Vznikají řadou na sebe navazujících reakcí
 Důležité 2 enzymy:
 syntáza kyseliny 5 – aminolevulové
tvorba kyseliny 5 - aminolevulové (ALA) z glycinu a sukcinátu
 porfobilinogensyntáza
vznik porfobilinogenu z 2 molekul ALA
 Glycin + sukcinykoenzym A → kyselina 5.aminolevulová (ALA) →
porfobilinogen (ze 2 ALA) → uroporfyrinogeny → po oxidaci
uroporfyriny→ koproporfyrinogeny → po oxidaci koproporfyriny →
protoporfyrin IX→ po přijetí atomu Fe vzniká červený hem
Porfyrie - defekt tvorby kteréhokoliv enzymu syntézy porfyrinů za
stupněm ALA (typická vysoká koncentrace ALA)
Syntéza hemu
Porfyriny – biosyntéza
http://www.reactome.org/figures/porphyrin_biosynthesis.j
pg
Porfyriny
Poruchy metabolismu porfyrinů:
 Získané (např. při otravě olovem)
 S dědičným podkladem – porfyrie
Porfyrie:
 Metabolické poruchy
 Charakterizovány:
– hromaděním porfyrinů nebo jejich prekurzorů v některých
tkáních
– zvýšenou hladinou v plasmě či v erytrocytech
– zvýšeným vylučováním porfyrinů nebo jejich prekurzorů
stolicí nebo močí
Porfyrie - dělení
 Dle místa zvýšené koncentrace
– Erytropoetické
– Jaterní
 Dle původu
– Vrozené
– Získané
 Dle průběhu
– Akutní
– Chronické
 Dle projevu
– Kožní
– Jaterní
Porfyrie – klinické příznaky
 Akutní bolest v břiše, neurologické příznaky
– Vysoká koncentrace 𝛿 – ALA a porfobilinogenu –
neurotoxický účinek
 Fotosenzitivita
– Intenzivní absorpce světla (400 nm) v kůži
nemocných – aktivace porfyrinové molekuly –
uvolnění volných radikálů – poškození kůže
Porfyrie
Klinické projevy porfyrií
Pozdní kožní porfyrie (PCT)
- vysoká zranitelnost kůže, spontánní tvorba puchýřům hyperpigmentace
- klinická manifestace často iniciována současným jaterním postižením (nadměrná
konzumace alkoholu, hepatitida C, vzácně estrogeny)
- neléčená může vést ke vzniku karcinomu jater
Akutní ataky (AIP)
- křečovité až agonizující bolesti břicha
- další příznaky: např. tachykardie, zvracení, křeče
Pozn.: Důležitá prevence
- akutní ataka často vyvolaná použitím léků, kt. nemocní nesmějí dostat
- nutné, aby co nejširší okruh členů rodiny věděl, zda porfyrií trpí či nikoli
- pokud je ale jedinec nositel genu, ale neprodělal klinický záchvat, je dg. na
základě fluorescenčních a fotometrických metod obtížná -> zjišťování genové mutace
Porfyrie
Symptomatická jaterní porfyrie (Porfyria cutanea tarda)
 nejčastější, patří mezi jaterní porfyrie (poškození jater)
 při nedostatku uroporfirogen dekarboxylasy
 objevuje se v pozdějším věku
Akutní intermitentní porfyrie
 porucha přeměny porfobilinogenu a porucha metabolismu steroidů
v játrech (hromadí se a indukují tvorbu syntázy ALA)
Celá řada dalších typů porfyrií
Rozlišení typů - analýza porfyrinů nejčastěji v moči
- zřídka v plasmě, erytrocytech a stolici
- analýza enzymů - výjimečně, v ČR se provádí ve
VFN Praha (dehydratáza 5-aminolevulátu)
Stanovení porfyrinů
 Konjugované dvojné vazby – barevnost hemu,
porfyrinů
 Redukované formy porfyrinů – bezbarvé,
po neenzymové oxidaci vzniklé porfyriny jsou
barevné (absorbují záření s maximem 400nm,
kyselé roztoky nebo roztoky v org. rozpuštědlech
po excitaci UV záření fluoreskují)
Stanovení celkových porfyrinů:
 Spektrofotometrická křivka v oblasti 350-450 nm
Charakteristické absorbční spektrum – Soretův pás,
s maximem okolo 400 nm
 Při větším podílu uroporfyrinu – posun abs. maxima na 405 nm
 Materiál: okyselená jednorázová moč (kys. sírová)
nutno chránit před světlem
 Fyziologické rozmezí je do 144 ug/l (0,22 μmol/l)
 V případě pozitivity následuje další vyšetření moče – stanovení
jednotlivých porfyrinů, stanovení prekurzorů porfyrinů (ALA, PBG), a
případně i enzymů v krvi podílejících se na tvorbě a přeměně porfyrinů
(výjimečně).
 Méně často možnost stanovení porfyrinů ve stolici, erytrocytech či
plazmě
Stanovení jednotlivých porfyrinů:
 V kyselém prostředí po ozáření UV světlem (400 nm) silně
fluoreskují v červené oblasti (550-650 nm)
 Okyselená moč metodou HPLC na reverzní fázi s použitím
fluorescenčního detektoru (fosf. pufr, metanol)
 Materiál – sbíraná moč za 24 hod, konzervovaná Na2CO3
Nutno chránit před světlem
 Referenční rozmezí
Uroporfyrin : do 0,050 µmol / 24 hod
Koproporfyrin : do 0,280 µmol / 24 hod
Heptaporfyrin : do 0,014 µmol / 24 hod
Hexaporfyrin : do 0,006 µmol / 24 hod
Pentaporfyrin : do 0,005 µmol / 24 hod
Stanovení celkových porfyrinů
Matouš B. a kol. Základy lék. chemie a
biochemie. Galén Praha
Chromatogram s píky jednotlivých porfyrinů
Zdroj: TIETZ Textbook of Clinical
Chemistry and Molecular
Diagnostic, Washington, 2006
Stanovení porfyrinů
a jejich prekursorů - kvantitativně
Stanovení porfobilinogenu (PBG) v moči - spektrofotometricky:
 Reakce porfobilinogenu v kyselém prostředí
s p-dimetylaminobenzaldehydem
 Vznik červeného kondenzačního produktu
 Referenční rozmezí: do 36 umol/l
Stanovení 5-aminolevulátu v moči - HPLC:
 5-aminolevulát se reakcí s acetylacetonem a formaldehydem
převede na fluorescenční derivát
 Stanovení HPLC metodou s fluorescenčním detektorem
 Referenční rozmezí: do 20 umol/l
Hemoglobin
Hemoglobin
 Transportní metaloprotein, červeně zbarvená bílkovina v erytrocytech
 Přenos krevních plynů - především O2 z plic do periferních tkání,
ale i části CO2 v opačném směru (reverzibilní vazba)
 Důležitý pufrační systém krve – vazba H+ na postranní řetězce His
(především v periferní tkáni)
 Většina hemu se tvoří v kostní dřeni, při jeho odbourávání dochází
k tvorbě žlučových barviv
 Degradací globinu vznikají aminokyseliny
 Volný Hb se váže na haptoglobin – ochrana ledvin
 Koncentrace Hb v krvi:
B P U
ženy: 120-165 g/l
muži: 130-175 g/l
Do 50 mg/l
>300mg/l intravaskulární hemolýza
0 arb.j.
Hemoglobin
 Tetramer – podjednotky spojeny H-můstky a iontovými vazbami
 Každá podjednotka složena z proteinové části – globinu a prostetické
skupiny – hemu s centrálním kationtem Fe2+ (pevně vázán
koordinačně kovalentními vazbami)
 Patří mezi konjugované bílkoviny - spojením bílkoviny s organickým
komplexem obsahujícím kov
 Hemoglobin tvořen z hemu (protoporfyrin IX s navázaným Fe2+ )
a bílkoviny globinu
 Globin je tvořen 4 polypeptidickými řetězci: např. dvěma řetězci 
a dvěma řetězci 
 Molekula ve tvaru čtyřstěnu
 Každý globinový řetězec je v jednom rohu, porfyrinové řetězce jsou
umístěny v dutinách řetězců s atomem Fe uprostřed
 Hemoglobin: 4 polypeptidické řetězce (např. 2 a 2), 4 hemy, 4 Fe
Hemoglobin
 několik typů molekul Hb – rozlišujeme podle globinových řetězců (α, β, γ, δ, ε a ζ):
Adultní Hb (HbA):
- HbA1 (2α2β): majoritní forma Hb u dospělých a dětí nad 7 měsíců
- HbA2 (2α2δ): minoritní forma Hb dospělých
Fetální Hb:
- HbF (2α2γ): tvořen u plodu, po narození je odbouráván a nahrazován Hb A;
u novorozenců až 70% celkového Hb
Embryonální Hb
- tvořen u embryí buňkami krevních ostrůvků žloutkového váčku v prvních týdnech vývoje,
později je nahrazen Hb F
- Gower I (2ζ2ε), Gower II (2α2ε), Portland (2ζ2γ)
Podíl Hb u dospělých:
96% HbA1 (22)
2-3% HbA2 (22 )
1 % HbF (22)
Deriváty hemoglobinu
 Oxy-/deoxyhemoglobin (oxy/deoxyHb) – s navázaným O2 nebo bez
navázaného O2 (železo ve formě Fe2+, v oxidované i neoxidované formě)
 Karbaminohemoglobin (HbCO2) – fyziologický komplex s oxidem uhličitým
(CO2 navázaný přes -NH2 konec β řetězce)
 Karbonyl /Karboxyhemoglobin (COHb) - vniká při otravách s CO reversibilní
vazba CO, který se na Fe2+ váže asi 200-300x pevněji než O2) - i když je vazba
reverzibilní, za normálního tlaku jej O2 z vazby nevytlačí; snížená schopnost
krve transportovat kyslík ⇒ tkáňová hypoxie (kuřáci, otrava CO), konc. v krvi
< 0,5 %
 Sulfhemoglobin – směs oxidovaného a částečně denaturovaného Hb
vzniklého během oxidativní hemolýzy, během oxidace Hb vazba atomu síry,
nemůže vázat kyslík ale CO ano
 Kyanhemoglobin (HbCN) – otravy kyanidy
Deriváty hemoglobinu
 Methemoglobin (metHb) – vzniká z hemoglobinu oxidací železa Fe2+ na Fe3+
- neschopnost reverzibilně vázat kyslík, normálně konc. v krvi pod 1,5 %
- hnědé zbarvení krve
- zpětná redukce: NADH methemoglobin reduktáza (není plně vyvinutá u
dětí do 1 roku, navíc: u dětí větší aktivita interstinální flóry (hlavně E.coli) =
větší redukční schopnost – přeměna dusičnanů na dusitany)
= riziko methemoglobinemie u dětí při pití vody s obsahem
dusičnanů
- oxidaci Fe2+ na Fe3+ mohou způsobovat např. i anilíny (barviva)
nebo sulfoamidy (léčiva)
- Kongenitální methemoglobinémie - údržba Fe2+ narušena nedostatkem
NADH methemoglobin reduktázy (riziko methemoglobinemie u dětí při pití
vody s obsahem dusičnanů)
- Metabolická acidóza nebo kóma - zvýšení konc. methemoglobinu
- Hladiny nad 70% mohou být letální
Deriváty hemoglobinu
 Glykovaný Hemoglobin (HbA1C)
- neenzymatická vazba glukózy na řetězce globinu udává se v mmol
glykovaného/mol celkového hemoglobinu
- za normálních podmínek asi 20 – 42 mmol/mol,
u dobré kompenzace diabetu do 53 mmol/mol
- parametr pro zpětné sledování compliance pacienta při léčbě diabetu
- Vysoká hodnota (>60 mmol/mol] – vysoké riziko rozvoje dlouhodobých
komplikací (retino-, nefro-, neuro-, kardiopatie)
- Posouzení dlouhodobé kompenzace diabetu (6-8 týdnů zpětně)
Talasémie, Hemoglobinopatie
Hemoglobinopatie:
 Strukturální abnormality jednoho nebo obou globinových řetězců (záměna
aminokyseliny v řetězci)
 Více než 900 typů, většina se klinicky nemanifestuje
 Více než 100 druhů anemií má nestabilní  či  globinové řetězce – nestabilní
hemoglobinová hemolytická anémie
 Srpkovitá anémie - u homozygotů defekt tvaru erytrocytů, anémie, bolest
kloubů, infarkt různých orgánů - S forma hemoglobinu (záměna kys. glutamové
za valin)
Talasémie:
 Dědičné poruchy - změna poměru syntézy jednoho či druhého globinového
řetězce
  -talasémie (Afrika, jihovýchodní Asie) – redukce  řetězců
  -talasémie (Středomoří, Indie, jižní Čína) – redukce  řetězců
 Množství variant, kombinace talasémií
 Někdy bez klinických příznaků, jindy s výraznou anémií
Stanovení Hb a jeho derivátů
 Spektrofotometrické měření – tHb i jeho deriváty mají charakteristická absorpční
spektra ve viditelné oblasti záření
⇒ typická výrazná absorpční maxima v oblasti 400–430 nm
(Soretův pás), další absorpční vrcholy jsou podstatně nižší
Stanovení hemoglobinu
 Nejčastěji v plné krvi
 Stopy v séru, plasmě, moči a stolici - na základě
pseudoperoxidázové aktivity - hem obsahující Fe2+ katalyzuje
oxidaci některých barviv benzidinového typu peroxidem vodíku
Stanovení Hb v plné krvi s hexakyanoželezitanem (Drabkin) –
referenční metoda (dříve jako součást stanovení krevního
obrazu,1966 mezinárodní standard, pomalá a nesnadno se
automatizuje, toxický odpad):
 Hb se lyzačním roztokem (hypotonický pufr) uvolní z erytrocytů
 Hb + Fe (CN) 6
3-  MetHb + Fe (CN)6
4
Met Hb + CN-  MetHbCN
 Vznik kyanidového komplexu, měří se fotometricky při 540 nm
Stanovení Hb v plné krvi
 Součást stanovení krevního obrazu (na hematologických
automatech ):
- nejprve se přídavkem speciálního roztoku zlyzují
erytrocyty
- pak se přidá transformační roztok – vzniká komplex lauryl
sulfát sodný – Hb (Sysmex) nebo imidazol – Hb.
- vzniká opticky stálý komplex barevný komplex – stanoví se
fotometricky
- metoda rychlá, netoxická, snadno se automatizuje, přesně
měří i vzorky s obsahem methemoglobinu a kontrolní krve
 V biochemii jako součást ABR analyzátorů - měření
absorpce světla v plné krvi (využití rozptylu světla červenými
krvinkami - světelným zdrojem je laser
Stanovení derivátů hemoglobinu
(v plné krvi)
 Provádí se na oximetrech -samostatné přístroje
- oximetrický modul součást přístrojů na ABR
 Deriváty hemoglobinu - měří se
spektrofotometricky na základě Lambert-Beerova
zákona
 Stanovuje se celkový hemoglobin, oxyhemoglobin,
karbonylhemoglobin, methemoglobin a
sulfhemoglobin
 K methemoglobinu i sulfhemoglobinu jsou rovněž
popsány fotometrické metody
Stanovení hemoglobinu
Stanovení glykovaného hemoglobinu:
 Stanovení frakce HBA 1c zvýšené u diabetiků
 Metody HPLC, kapilární elfo
Stanovení hemoglobinu ve stolici:
 Screening na OK – viz. screeningová stanovení
Stanovení hemoglobinu v moči:
 Součást chemické analýzy moče s diagnostickými
proužky
Stanovení volného hemoglobinu
v plasmě nebo séru
 < 50 mg/l
 Metoda pro zjištění intravaskulární hemolýzy (> 300 mg Hb/l)
 Šetrný odběr - nádobka s heparinátem litným, stáčet při
2000ot/min
Ruční metoda:
 Absorpční spektrum při 340 – 600 nm, derivuje se
max. 403 – 405 nm
Metoda na automatickém analyzátoru:
 semikvantitativní stanovení
 využívá měření sérových indexů (hemoglobin, lipidy, bilirubin).
 proměřuje se absorbance při šesti vlnových délkách (480, 505,
570, 600, 660 a 700 nm)
Identifikace hemoglobinových variant
 Dříve se používala elektroforéza
 Dnes dominují molekulární techniky,
imunometody, HPLC, kapilární elektroforéza
a MS
Bilirubin
 Lineární tetrapyrolové barvivo, hydrofobní charakter
 Přirozené žluté barvivo
 Není jednotná látka - řada tetrapyrolů
 žlučové barvivo, nadbytek → žluté zabarvení sliznic a kůže –
žloutenka (ikterus)
 Produkt katabolismu hemoproteinů (hemoglobin, myoglobin, katalasa,
cytochromy)
 Většina (85%) vzniká z uvolněného hemoglobinu při rozpadu
erytrocytů
 V krvi většina bilirubinu vázána na albumin
Odbourávání Hb
 Retikuloendotelový systém (RES): játra, slezina, kostní dřeň
 Životnost erytrocytů 120 dní
 Rozpad ery → uvolnění Hb → hem → biliverdin → nekoj. bilirubin → konj. bilirubin (játra)
→ žluč → urobilinogen (střevo) → sterkobilin (stolice) / urobilin (moč)
 Degradace hemu:
 Biliverdin (zelený) → nepřímý bilirubin (žlutý), ve vodě nerozpustný
 Bilirubin vázaný na albumin transportován do jater
 V játrech extrahován hepatocyty, uvolnění vazby na albumin, vazba na kyselinu
glukuronovou – stává se ve vodě rozpustným
 Konjugovaný bilirubin vylučován žlučovými cestami do tenkého střeva
 Ve střevě redukce na bezbarvé urobilinogeny, které se dále přeměňují na další barevné
produkty urobiliny, sterkobiliny (oranžová barviva)
 Část vstřebána zpět do jater (enterohepatální oběh), část vylučována močí a stolicí
 U zdravého člověka se močí žádný bilirubin nevylučuje
Konverze hemu na biliverdin
a redukce biliverdinu na bilirubin
Hemová skupina, bilirubin
hem bilirubin
Bilirubin- přímý a nepřímý
 Bilirubin přímý
– Dává po přidání směsi diazočinidel k séru přímo zbarvení
– Přímý odpovídá bilirubinu konjugovanému - podíl, který již
prošel játry, kde byl konjugován s kys. glukuronovou
 Bilirubin nepřímý
– Nerozpustný ve vodě, vázaný na albumin, dosud játry
neprošel
– Nekonjugovaný, je třeba uvolnit z vazby na albumin
(kofeinu, benzoátu sodného)
– Toxicita – proniká do lipofilní tkáně, včetně CNS
Sérum nutno chránit před přímým světlem – pokles
Ikterus
(hyperbilirubinemie)
 Prehepatální (hemolytická) žloutenka
– Zvýšený rozpad erytrocytů
– ↑ nepřímý bilirubin v séru
– Negativní nález v moči
– Hemolytická anemie, novorozenecká žloutenka, Rh inkompatibilita matky a
plodu
 Hepatální (jaterní) žloutenka
– Poškozené hepatocyty (alkoholem, toxiny, viry)
– ↑ celkový, konj. bilirubin v séru
– Pozitivní nález v moči
 Posthepatální (obstrukční) žloutenka
– Uzávěr žlučových cest (litiáza, nádor...)
– ↑ celkový, konj. bilirubin v séru
– Pozitivní nález v moči
– Úplná obstrukce → přerušení odtoku žluči → absence degradačních produktů
bilirubinu → acholická stolice (šedo-bílá)
Referenční hodnoty
 Bilirubin celkový S/P:
dospělí do 20 umol/l
novorozenci 1den do 100 umol/l
novorozenci 2dny do 120 umol/l
novorozenci 3dny do 205 umol/l
 Bilirubin přímý S/P:
dospělí do 5 umol/l
 U 0 arb. jednotek
Bilirubin
 Doporučená rutinní metoda: Jendrassik –
Gróf, fotometrické metody s DCA a DPD
 Referenční metoda: Doumas – Perry
Stanovení bilirubinu - historie
Reakce bilirubinu s diazotovanou kyselinou
sulfanilovou – Ehrlich v r. 1883 - současné
metody z reakce vychází
Stanovení bilirubinu
Metoda Doumase - Perry (r. 1985):
 Vychází z metody Jendrassik – Gróf,
všechny kroky optimalizovány a specifikovány
Stanovení bilirubinu celkového a přímého
s diazotovanou kyselinou sulfanilovou
Metoda Jendrassik – Gróf ( r. 1938):
 Azokopulační metoda
 Přidat diazotovanou kyselinu sulfanilovou (činidlo z dusitanu
sodného a kyseliny sulfanilové)
 Vznik červeně zbarveného azobilirubinu s abs. max. 440 nm
(interferuje hemolýza)
 Modrá forma azobilirubinu – po 10 minutách k reakci přidat
NaOH a vínan sodno-draselný - 600 nm, hemolýza nevadí
 Celkový bilirubin - po přídavku akcelerátoru - kofein + benzoát
(Při stanovení bilirubinu konjugovaného se tento krok vynechá)
 Při stanovení přímého bilirubinu reakci zastavit kyselinou
askorbovou
Kopulace bilirubinu s diazotovanou kyselinou
sulfanilovou - tvorba azobilirubinu
Stanovení bilirubinu celkového s DPD
 Celkový bilirubin v přítomnosti vhodného solubilizačního
činidla kopuluje s diazoniovými ionty v silně kyselém
prostředí
 Rychlá reakce dichlorofenyldiazonium tetrafluoroborátu
(DPD) s bilirubinem - tvorba azobilirubinu
kyselina
Bilirubin + diazoniový iont ----------> azobilirubin
 Intenzita červeného zabarvení je přímo úměrná celkovému
bilirubinu a může být stanovena fotometricky
 V praxi nejrozšířenější metoda
 Hemolýza ruší až od vysokých koncentrací hemoglobinu
Stanovení bilirubinu
Enzymové stanovení bilirubinu přes biliverdin:
 Oxidace bilirubinu kyslíkem na zelený biliverdin
– s bilirubinoxidasou
 Měří se pokles absorbance – 424 - 465 nm
 Běžně se nepoužívá
Stanovení bilirubinu přímou spektrofotometrií
u novorozenců:
 Absorbance se měří při 454 nm
 Metoda nelze použít u starších - přítomnost
karotenu a jiných pigmentů
Interpretace biochemických nálezů
 Kámen žlučníku
 Jaterní selhání
 Virová hepatitida
 Alkoholismus
 Porfyrie