Adobe Systems Genová terapie a farmakogenetika Farmakogenetika 2 Cíl nNa základě interdisciplinárního integrace znalostí farmakologie a genetiky popsat vliv dědičnosti na odpověď organismu na různé léky. n ØFarmakogenomika üFarmakodynamika: popisuje žádoucí či nežádoucí účinky léků na organismus n (lék® organismus) üFarmakokinetika: se zabývá hladinami léků a jeho metabolitů v různých tkáních a vstřebáváním léků, jejich distribucí, metabolismem a eliminací n (organismus ® lék) 3 Obsah obrázku text, osoba, interiér, noviny Popis byl vytvořen automaticky Image Klíčové složky farmakogenetiky 4 Faze a faktory rozhodujici o reakci na L 5 Vztah ke genům nTéměř každá dráha metabolismu léku, jeho transportu nebo aktivace je ovlivněna genetickou variabilitou. n ¨Klinická variabilita v odpovědi ¨Riziko vedlejších účinků ¨Genotypově specifické dávkování ¨Polymorfní cíle léku ¨ n 6 Image 20-90% individuální odpovídavosti na předepsanou léčbu souvisí s genetickou variabilitou. 59% z 27 nejčastěji citovaných léků s ohledem na nežádoucí účinky - genetické varianty se sníženou funkcí nebo nefunkčností proteinů. NEJM 348; 529-538, 2003 / JAMA 286; 2270, 2001) 7 Image Klinický potenciál farmakogenetiky 8 Výhody „Genomické medicíny“ – klinický potenciál nOdhalení onemocnění v raném stádiu, kdy je snadnější účinně léčit; nUsnadnění výběru optimální léčby a omezit léčbu pokus-chyba; nSnížení výskytu nežádoucích účinků; nZvýšení odpovídavosti pacienta na léčbou; nZlepšení výběru cílů ve vývoji léků a snížit čas, náklady a selhání klinických zkoušek; nDůraz na prevenci; nSnížení celkových nákladů na zdravotní péči. 9 Farmakogenetika a vývoj léků ØNutnost přesné diagnózy (k fenotypicky podobným stavům mohou vést různé patobiochemické mechanismy). ØIndividuální odpověď jedince na terapii může záležet na genech, vstupujících do interakce s metabolismem léku nebo jeho působením. Ø 10 Image Klinicky relevantní genetické polymorfismy ve vztahu k vedlejším účinkům léků 11 Cytochrom P4502C9 (CYP2C9) ndvě alelické varianty genu CYP2C9 1, 2 ¨CYP2C9*2 nzáměna C430T v exonu 3 vede k substituci Arg144Cys ¨CYP2C9*3 nzáměna A1075C v exonu 7 vede k substituci Ile359Leu n nin vitro má CYP2C9*1 normální, zatímco varianta CYP2C9*2 vykazuje menší a CYP2C9*3 podstatně menší enzymatickou aktivitu 3, 4 n nfenotypickým projevem je snížení clearance léků závislých na CYP2C9 1. Stubbins MJ et al: Pharmacogenetics 1996; 6:429-329 3. Rettie AE et al: Pharmacogenetics 1994; 4:39-42 2. Veronese ME et al: Biochem J 1993; 289:533-8 4. Haining RL et al: Arch Biochem Biophys 1996; 333:447-58 12 V bílé rase byly popsány dvě alelické varianty CYP2C9 – CYP2C9*2 a CYP2C9*3.^1, 2 Varianty CYP2C9*2 a CYP2C9*3 se liší od wild-type CYP2C9*1 bodovou mutací: CYP2C9*2 záměnou C^430T v exonu 3 vedoucí k substituci Arg^144Cys a CYP2C9*3 záměnou A^1075C v exonu 7 způsobující substituci Ile^359Leu v katalytické části molekuly enzymu. In vitro je nemutovaná forma CYP2C9*1 spojovaná s normální enzymatickou aktivitou, zatímco mutovaná varianta CYP2C9*2 má sníženou a varianta CYP2C9*3 podstatně nižší aktivitu.^3,4 Fenotypickým projevem je snížení clearance léků závislých na aktivitě CYP2C9.^8 P450 nCYP3A4 – 50% metabolizovaných léků nCYP2D6 – 20% nCYP2C9 + CYP2C19- 15 % nCYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 a CYP2A6 byly prokázány jako funkčně polymorfní n nNapř. ovlivňuje metabolismus warfarinu, acenocoumarolu a dalších léků (phenotyoin, tolbutamid, glipizide a další perorální antidiabetika typu sulfonylurey). n 13 Dávka / antikoagulační efekt warfarinu 12. Alving BM et al: Arch Intern Med 1985; 145:499-501 13. Oldenburg J et al: Br J Hematology 1997; 98:240-4 12 13 14 Vztah mezi dávkou warfarinu a jeho antikoagulačním účinkem závisí na celé řadě faktorů a hrají zde významnou roli jak genetické vlivy tak vlivy prostředí. Kromě polymorfismu genu CYP2C9 je klinicky významný geneticky podmíněný syndrom rezistence na warfarin, daný snížením afinity jaterního receptoru pro warfarin k léku. Nosiči této odchylky vyžadují pro dosažení terapeutického rozmezí 5-20-ti násobné dávky warfarinu.^11 Druhou známou genetickou abnormalitou je mutace propeptidu FIX, která vede ke krvácení bez excesivního prodloužení PT. Výskyt této odchylky je pod 1,5% populace a etiopatogenetický mechanismu vedoucí ke krvácení je dán významným poklesem aktivity FIX (na 30-40%) při terapii kumariny.^12 Klinicky nepochybně nejvýznamnější a zcela jednoznačně nejproměnlivější jsou vlivy prostředí a z nich lékové interakce s warfarinem. V konečném důsledku spolu genetické vlohy a vlivy prostředí různě reagují s důsledkem rozmanité inter- i intraindividuální variability efektu warfarinu. 15 CYP2C9 ACTIVITA Prescribed Daily Warfarin Dose and CYP2C9 Genotype Warfarin Dose (mg) Genotype 5.63 ± 2.56 *1/*1 4.88 ± 2.57 *1/*2 3.32 ± 0.94 *1/*3 4.07 ± 1.48 *2/*2 2.34 ± 0.35 *2/*3 1.60 ± 0.81 *3/*3 *Data presented as mean (SD) daily dose in mg From: Higashi MK, et al. Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy. JAMA 287:1690-1698, 2002. Klinické projevy polymorfismu CYP2C9 npředávkování při zahájení antikoagulace standardními režimy 14, 16, 17, 18, 19 n nnižší udržovací dávka nutná k dosažení a udržení terapeutického rozmezí 11, 15, 16, 18, 19 n nvyšší riziko předávkování dané interakcemi s léky metabolizovanými a/nebo reagujícími s CYP2C9 17, 21 n nnestabilita antikoagulační terapie 15, 16 n ndelší přetrvávání antikoagulačního efektu po přerušení léčby nebo snížení dávky warfarinu 14. Aithal GP et al: Lancet 1999; 353:717-9 16. Higashi HK et al: JAMA 2002; 287:1690-8 15. Taube J et al: Blood 2000; 96:1816-9 17. Verstuyft C et al: Eur J Clin Pharmacol 2003; 58:739-45 16 Aithal a spol. studovali vliv polymorfismu CYP2C9 na dávkování warfarinu. Srovnávali skupinu pacientů s udržovací dávkou warfarinu pod 1,5 mg/den (n=36) s pacienty s širším spektrem denní dávky (n=52) a s kontrolní skupinou zdravých dárců (n=100). Odds ratio pro pacienty s mutacemi bylo ve srovnání s nemutovanými 6,21 (95% CI 2,48-15,6). Pacienti vyžadující nízkou dávku byli daleko častěji předávkováni v úvodu terapie (5,97[2,26-15,82]) a měli zvýšené riziko významných krvácivých komplikací (rate ratio 3,68[1,43-9,50]) ve srovnání s pacienty bez známek hypersenzitivity k warfarinu.^14 Taube a spol porovnávali průměrnou denní dávku warfarinu, potřebnou k dosažení terapeutického rozmezí antikoagulace 2,5 INR u 561 pacientů. Průměrná udržovací dávka byla v období dvou měsíců antikoagulační terapie u pacientů s bez mutace 5,01 mg, zatímco u pacientů s genotypem CYP2C9*2 a CYP2C9*3 jen 61% resp. 86% průměrné dávky wild-type pacientů.^15 Srovnáním směrodatné odchylky od průměrné hodnoty INR, procentuálního podílu vysokého INR a doby trvání terapeutického rozmezí stejní autoři nenašli významné rozdíly upozorňující na vliv polymorfismu na stabilitu antikoagulační terapie.^15 Higashi a spol. podrobně vyšetřili 185 pacientů se zavedenou antikoagulační terapií warfarinem z různých indikací. Wild-type (1*/1*) prokázali u 127 (68,6%) pacientů a některou z mutovaných variant u 58 (31,4%) nemocných. Pacienti s mutací měli vyšší riziko předávkování (hazard ratio 1,40 [95% CI 1,03-1,90]). Pacienti s variantními genotypy vyžadovali delší období nutné k dosažení stabilizované antikoagulace (hazard ratio 0,65 [95% CI 0,45-0,94]) s mediánem rozdílu 95 dní (p=0,004).^16 První studii porovnávající vliv polymorfismu CYP2C9 a faktorů zevního prostředí na efekt warfarinu publikovali v 2003 Verstuyft a spol. Z výsledků srovnání 75 warfarinizovaných pacientů s anamnézou PT přes 4,0 INR se 75 pacienty s PT mezi 2,0-3,5 INR uzavírají, že genotyp CYP2C9*3/CYP2C9*3 vede k vyššímu riziku dramatického předávkování v úvodu léčby, předávkování v době udržovací léčby je spíše navozeno zevními vlivy – především lékovými interakcemi.^17 Interakce s léky metabolizovanými a/nebo reagujícími s CYP2C9 Soutěž o substrát Enzymový induktor Enzymový inhibitor ASA a většina NSAID rifampicin fluvoxamin (ostatní SSRI slabí) fenobarbital, fenytoin fenobarbital, fenytoin omeprazol S-warfarin karbamazepin inhibitory HMG-CoA reduktázy losartan tolbutamid tolbutamid cimetidin (slabý) sulfonamidy, dapson azolová antimykotika (slabá) diazepam, tenazepam ritonavir fluoxetin, moclobemid desethylamiodaron zidovudin 17, 20, 21 20. Topinková E et al: Postgrad Med 2002; 5:477-82 21. Naganuma M et al: J Cardiovasc Pharmacol Ther 2001; 6:636-7 17 metabolizatori 18 Rychlost metabolismu nDle aktivity enzymu může být populace rozdělena do čtyř hlavních skupin - pomalí metabolizátoři (PM), intermedierní metabolizátoři (IM), efektivní metabolizátoři (EM) a ultrarychlí metabolizátoři (UM). nVětšina jedinců bílé populace patří mezi tzv.extenzivní metabolizátory (EM), u nichž jsou léčiva metabolizovány předpokládanou rychlostí. n5-10 % jedinců je geneticky determinováno jako pomalí metabolizátoři (PM), kteří mají zpomalené odbourávání látek metabolizovaných a jsou ohroženi vyšším výskytem nežádoucích účinků léčby. nIntermedientní metabolizátoři (IM) jsou zastoupeni v 10-15 % a při dlouhodobé léčbě jsou svými reakcemi na léčbu srovnatelní se skupinou PM. nU ultrarychlých metabolizátorů (UM) probíhá metabolizace intenzivněji a klinicky nereagují na běžné dávky léků a je zastoupena v 5-10 %. Metotrexát u RA nEfektivita léčby revmatoidní artritidy (RA) metotrexátem (MTX) 46% - 65 % (ACR 20) nPři léčbě MTX se mohou vyskytnout nežádoucí účinky. Alespoň jeden u 72,9% pacientů, závažné až u 30% pacientů. ¨gastrointestinální toxicita (nevolnost, zvracení, průjem, 20% - 65%) ¨hepatotoxicita 10% - 43% ¨orální ulcerace 37% ¨alopecie až 4% ¨pulmonální toxicita 2,1% - 8% ¨útlum kostní dřeně lehký 12% ¨pancytopenie 0.8% 20 Foláty Gastrointestinální toxicita Dihydrofoláty Adenosin - uvolňování 5,10-methylen tetradydrofolát 5,10- methenyl tetrahydrofolát 10- formyl tetrahydrofolát 5-methyl tetradydrofolát Syntéza polyaminů 21 Obsah obrázku exteriér, žena, osoba Popis byl vytvořen automaticky Účinek MTX v buňce – cíle pro SNPs nMTXPG přímo inhibuje enzymy důležité pro syntézu purinů a pyrimidinů – thymidylát syntázu (TYMS) a dihydrofolát reduktázu (DHFR). DHFR se účastní na konverzi homocysteinu na methionin a tím pro syntézu polyaminů. nMetabolismus adenosinu nOvlivnění metabolismu adenosinu patří k nejdůležitějším mechanismům protizánětlivého působení metotrexátu. nMTXPG inhubuje 5-aminoimidazol-4-karboxamid ribonukleotid formyltransferáza (ATIC), tím zprostředkovává vliv na metabolismus adenosinu (imunosupresivní účinek). 23 Nitrobuněčný metabolizmus MTX – cíle pro SNPs nVstup do buněk pro foláty a antifoláty npřenašeč SLC19A1 nebo reduced folate carrier (RCF-1) nfolátové receptory (FR-α a FR-β), endocytóza - nižší afinita MTX k receptorům než foláty (malý význam metabolické cesty) nTransport MTX z buňky - efluxní transportéry z rodiny ABC (ATP-binding cassette) např. (ABCC1-4 a ABCG2). nIntracelulární metabolizmus – přidání 2 až 5 glutamátových skupin → aktivní metabolit, polyglutamát metotrexátu (MTXPG), v buňce se hromadí. Tento proces je katalyzován folylpolyglutamát syntetázou (FPGS) a je reverzibilní prostřednictvím gamaglutamyl hydrolázy (GGH) n 24 Methotrexát Ranganathan P, McLeod HL. A&R 2006 25 Methotrexát Ranganathan P, McLeod HL. A&R 2006 26 nMicroRNA (miRNA) – regulace genů důležitých pro funkci léků. nInterakce miR-gen–lék prostřednictvím degradace farmakologicky relevantního cíle. 27 (A) An example of an experimentally verified miRNA pharmacogenomic set. miR-125 b inhibits vitamin D receptor (VDR) expression. Rukov J L et al. Brief Bioinform 2013;bib.bbs082 © The Author 2013. Published by Oxford University Press. (A) An example of an experimentally verified miRNA pharmacogenomic set. miR-125 b inhibits vitamin D receptor (VDR) expression. VDR is a co-factor for calcitriol, and lower protein levels decrease calcitriol efficacy [26]. (B) The concept of miRNA pharmacogenomics. While increased levels of miRNA always inhibits gene expression, protein levels can either increase or decrease drug response, depending on protein function. Together, a miRNA, a target gene and a drug that interacts with the target gene’s product forms a miRNA pharmacogenomic set. (C) Sources integrated in Pharmaco-miR. miRNA targets are fetched from VerSe, miRecords [10], miRTarBase [9], TargetScan [14], miRanda [7] and PITA [8], and gene–drug interactions are from VerSe or annotated by the Pharmacogenomics Knowledge Base [37]. (D) The conceptual difference between searching for ‘all associations’ and ‘overlapping associations’. When searching for all associations, the output consists of all miRNA pharmacogenomic sets which contain at least one of the input parameters, while when searching for overlapping associations the output consist of miRNA pharmacogenomic sets that contain objects which are shared by all the search terms entered. In this example, by entering three genes as the search entries and choosing ‘all associations’, both miR-A and miR-C are included with one set each (miR-A–Gene 1–Drug 1 and miR-C–Gene 3–Drug 3, respectively), while miR-B occurs in three sets (miR-B–Gene 1–Drug 1, miR-B–Gene 2–Drug 2 and miR-B–Gene 3–Drug 3). However, when choosing ‘overlapping associations’, at least one component in every output set must be associated with all the search entries. In this example, only miR-B connects all three genes entered. Thus, only sets with miR-B occur in the output, while sets with miR-A and miR-C are not included. Notice that in this case, it is not necessary for any of the drugs to be associated with all three genes; it is sufficient that they occur in sets where miR-B is also present. 29 MGMT From: Esteller M, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. NEJM 243:1350-1354, 2000. Epigenetika MGMT – methylguanine-DNA methyltransferase Metylatilace promotoru MGMT silencing genu 30 MGMT From: Esteller M, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. NEJM 243:1350-1354, 2000. Perzonalizovaná medicína 31 Náklady 32 33 i3_Gene_Therapy Genová terapie: typy nemocí nInfekční nemoci nRakoviny nVrozené nemoci nNemoci imunitního systému 34 Genová terapie ØZahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta. ØDo buněk se transferují: geny, jejich části nebo oligonukleotidy. ØGenová terapie in vivo: transfer přímo do buněk pacienta ØGenová terapie ex vivo: modifikované buňky se vracejí do organismu Ø Genová terapie ØKlasická genetická terapie (dopravit geny do vhodných cílových buněk, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů) s cílem: Ø1. zajistit produkci látky, která chybí Ø2. aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky 36 Neklasická genová terapie ØInhibice exprese genů asociovaných s patogenezou ØKorekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese Ø ØSoučasná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací. ØEtické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací. 37 Rekombinantní léky je možno produkovat expresním klonováním v mikroorganismech nebo v transgenních zvířatech nV mikroorganismech: üVýhody: dostatečná množství produkovaných látek üNevýhody: üPozměněné produkty v důsledku odlišných posttranslačních úprav bílkovin se stejnou primární strukturou (glykosylace) üproblémy s purifikací nV transgenních zvířatech: ü možnost navodit podobné posttranslační systémy jako u člověka ü 38 „Genetically engineered“ protilátky a vakcíny nUměle produkované terapeutické protilátky jsou navrženy jako monospecifické (poznají jen jeden typ antigenního místa), které poznají specifické antigeny asociované s nemocí, což vede k zabití nemocných buněk nTypy nemocí: nLymfomy, leukemie, infekční nemoci, autoimunitní nemoci. nHybridomy = heterogenní směs hybridních buněk (vzniklých fúzí), které jsou schopny produkovat specifické protilátky (B lymfocyty imunizovaného zvířete) a přitom se v kultuře neomezeně dělit (nesmrtelný myší B-lymfocytární tumor). 39 Chimerické a humanizované protilátky ØRekombinantní protilátky humánní-hlodavčí ØHumanizace hlodavčích mAb umožňuje získat velké množství protilátek a zároveň zabránit imunitní odpovědi lidského příjemce: Øchimerické V/C protilátky ØCDR (complementarity determining regions) graft protilátky ØInfekční patogeny a antigeny nádorových buněk 40 GT4b 41 GT19 42 „Geneticky enginnered“ vakcíny ØPomocí rekombinantní technologie: ØVakcíny nukleových kyselin: Øbakteriální plasmidy s geny pro patogeny nebo tumorové antigeny, podávané i.m. v solném roztoku. Obsahují silný virový promotor. Ø„gene gun“ - zlaté perly, do nichž byla precipitována DNA 43 „Geneticky enginnered“ vakcíny ØGenetická modifikace antigenu – např. fúze cytokinu s antigenem ke zvýšení antigenicity ØGenetická modifikace virů- virové vektory ØGenetické modifikace mikroorganismů, které způsobí: Øodstranění genů nutných pro patogenezu Øexpresi exogenního genu v bakteriích nebo parazitech po jeho inzerci do těchto organismů 44 Technologie klasické genetické terapie nJedná se o zacílení buněk nemocné tkáně n ØGeny mohou být inzertovány do buněk pacienta přímo a nepřímo ØInzertované geny se mohou üIntegrovat do chromozomů üZůstat extrachromozomálně (epizomy) 45 Genetický transfer ØEx vivo üTransfer klonovaných genů do buněk v kultuře (transplantace autologních geneticky modifikovaných buněk) ØIn vivo üTransfer se děje přímo do tkáně pacienta. Pomocí liposomů nebo virových vektorů. 46 GT1b 47 Principy genetického transferu ØcDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např. pomocí silného virového vektoru. Následná inzerce genu se děje ØA) do chromozomu Øgen se bude rozšiřovat do dalších buněk Øzajištěna vysoká úroveň exprese (kmenové buňky) Ønáhodná inzerce-různá lokalizace –různá úroveň exprese-smrt jednotlivé buňky-rakovina (aaktivace onkogenu, deaktivace supresorového nebo apoptotického genu-výhoda transferu ex vivo. ØB) extrachromozomálně – nevýhoda nejistého dlouhodobého účinku 48 GT5b 49 GT6b 50 GT14 51 GT15 52 GT12b 53 Naked DNA Target Cell Therapeutic Protein AAV Retrovirus/Lentivirus Adenovirus Nucleus Principy genové terapie Metody doručení genu do tkáně vektor kapa-cita snadnost produkce integrace do genomu trvání exprese transdukce nedělících se buněk existující imunita bezpečnost přenos do potomstva nevirální bez limitu +++ zřídka dočasná ++ ne +++ ne onko-retroviry 8 kb ++ ano stabilní - ne inserční mutagenese aktivace onkogenů může lentiviry 8 kb + ano stabilní ++ ne inserční mutagenese aktivace onkogenů může adenoviry 30 kb + ne dočasná +++ ano hyperimunitní odpověď ne adeno asociated virus AAV 4.6 kb + možná dlouho-trvající ++ slabá +++ může Herpes viry 150 kb + ne dočasná ++ ano hyperimunitní odpověď ne Animal Models are Useful to Study Potential Gene Transfer Vectors ¨Animal Model Disease ¨MRL/lpr mice Lupus ¨W/Wv mice Fanconi’s anemia ¨Wobbler mice ALS ¨db/db mice Diabetes ¨spf mouse OTC deficiency ¨mdx mice Muscular dystrophy ¨cftr-KO mouse Cystic fibrosis ¨Watanabe rabbit Hypercholesterolemia ¨hemophilic dogs Hemophilias A/B ¨various MPS defects (dog, cat, rat) Lysosomal storage Nemoci v současnosti léčené genovou terapií - př. ve fázi klinického testování nnemoc defekt cílové buňky četnost n ntěžká imunodeficience adenin deaminasa buňky kostní dřeně 1/1.000.000 n(SCID) T-lymfocyty n nhemofilie krevní faktor VIII a IX játra, svaly 1/1.000.000 muži n nCystická fibrosa CF plicní alveoly 1/2.500 n nDeficience emfyzém plicní alveoly 1/3.500 nalfa-1-antitrypsinu n nrakovina nespecifické 1/4 n nNeurodegenerativní nemoci degradace neuronů neurony v mozku 1/250 n Parkinson, Alzheimer n ninfekční nemoci T-lymfocyty, makrofágy nAIDS, hepatitis B n n Cystická fibróza •mutace v iontovém přenašeči CFTR transmembrane conductance regulator • nejvíce postihuje plicní alveoly, střevní epitel a pankreas – zvýšena produkce hlenu, citlivost k plicním infekcím. • výhodou pro terapii je že stačí pouze několik molekul proteinu na buňku aby se jí vrátila normální funkčnost. •úspěšné pokusy v kulturách a na myších transformovaných pomocí liposomů •u lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru nesoucího transgen CFTR do nosu, účinné v plicích, nepůsobí na slinivku ¨ n cm022001306a principy genové terapie rakoviny nrc1101-130a-f2 nrc1101-130a-f2 doručení konstruktu zajišťující zastavení exprese onkogenu (antisense konstrukt) doručení nemutovaného supresorového genu p53 využití onkoretrovirálních vektorů principy genové terapie rakoviny doručení sebevražedného genu přeměňující pro-drug na toxin nrc1101-130a-f3 image003 Nanotechnology Based Drug Delivery Systems for Cancer Therapy Schematics - Reproduced from Sahoo and Labhasetwar, 2003 with kind permission from Drug Discovery Today. http://www.cancer-therapy.org/CT3A/HTML/13.%20Orive%20et%20al,%20131-138%20.html 2005 Děkuji vám za pozornost J 62