MUNI MED Metody molekulární biologie DNA diagnostika Mgr. Katarína Chalásová, PhD. Ústav patologické fyziologie, LF MU Osnova 1. Opakování pojmů z molekulární biologie 2. Genetická DNA diagnostika 3. Základní metody molekulární biologie 4. Praktická ukázka a vlastní provedení PCR ÍIUÍI I MED 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • nukleové kyseliny, rozdíl mezi RNA a DNA, • primární stavba DNA a RNA, dusíkaté báze, nukleotid, nukleosid • sekundární stavba DNA a RNA, dvojzávitnice, párování bází • replikace DNA - kde, kdy, enzymy, vedoucí a opožďující se řetězec • transkripce - kde, typy RNA, enzymy, posttranskripční modifikace • translace - kde, ribozomy, endoplazmatické retikulum, genetický kód, kodony vs antikodony, posttranslační modifikace • centrální dogma molekulární biologie • mutace vs polymorfismus M U N I MED 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • nukleové kyseliny, rozdíl mezi RNA a DNA • primární stavba DNA a RNA, dusíkaté báze, nukleotid, nukleosid esterová vazba 0 II HO-P-O— 1 OH N- f N N' ^h^^ N-glykosidová vazba kyselina trihydrogenfosforečná Q H 2-deoxy-D-ribosa nukleosid V. nukleotid 5'-konec o ^ IT adcnin adenin HO 0=P—O—CH HO O ľ" guanir, "i 20 I ' P O OH // JT Nřl J P 0=P — O—CH ej ]Sa H3C cytosin 0 P O CH HO 6 P thymin guanin 0 OH £ 0=P—O—CH 1 HO nA cytosin 0—p o-CH2 Ar uracil M u r j i E D 3'-konec 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • sekundární stavba DNA a RNA, dvojzávitnice, párování bází 3'-konec 5'-konec 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • replikace DNA - kde, kdy, enzymy, vedoucí a opožďující se řetězec • transkripce - kde, typy RNA, enzymy, posttranskripční modifikace 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • translace - kde, ribozomy, endoplazmatické retikulum, genetický kód, 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat • centrální dogma molekulární biologie • mutace vs polymorfismus . SNP>- General Special XLaboratory Only Viruses Only In all Living Cells Lower Life Forms u r j i E D 2. Genetická diagnostika a) postnatální diagnostika b) prenatální diagnostika c) preimplantační diagnostika 2. Genetická diagnostika ❖ Cvtogenetické vyšetření o vyšetřuje chromozomální aberace = odchylky na úrovni chromozomů o stanovuje se karyotyp, počet a struktura chromozomů K >? >L iLi) i JLJLJLJLJLJLl 7 & !jl IQ 11 1J U H ?7 >í (c II U 11 11 W 17 13 )i !í__ . ».t .. íi _ _ 0 X 11 H Při ,1 bľi II í? u • u u ii M II M 1» i* M M .. «... I I Placenta Fetus Uterus (womb) Amniotic fluid Cervix 2. Genetická diagnostika ❖ Molekulární genetika o vyšetřuje nemoci způsobené mutací v genu o identifikuje patologické změny DNA na molekulárni úrovni MUNI MED * některé cytogenetické metody G-pruhování = Giemsovo barvení • nejčastěji rutinně užívaná metoda • chromosomy vystaveny účinkům trypsinu a obarveny Giemsovým barvivem každý Chromosom se specificky obarví 11......11.......i.....Si << H (i n li l) II (I »7 II II (V 6 7 8 9 10 11 12 li It »» >« « 13 14 15 m 16 17 18 H li Ii «I I i S9 5 ft 7 S S: í I I H ,.s......li 10 II 12 13 14 15 16 17 IX IIa*» š 19 20 21 MU NI ED * některé cytogenetické metody Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) • fluorescenční obarvení části chromozomu pomocí komplementární sondy cílová DNA sonda denaturace D -ef ■ f> Reverse PCR primer Amplification Assay Fluorescence Probe displacement and deavage PCR Products Result fluorescence Cleavage Products MUNI MED Mgr. Katarína Chalásová, PhD. Ústav patologické fyziologie, LF MU