Imunoelektroforéza Imunofixace Mgr. Julie Štíchová ÚKIA-FNUSA Klasická elektroforéza - screening • Separace proteinů séra na základě rozdílné pohyblivosti v el. poli • Médium – agarózový gel • pH = 8,6  anodická pohyblivost (většina proteinů izoel. bod kolem pH 5 - 6) • Rozdělení do 5 základních frakcí • Odečítání – většinou denzitometrie • Pokud známe koncentraci celkové bílkoviny  přepočet % na koncentraci jednotlivých frakcí • Imunologie – zájem o gamafrakci Pozn. Detailní princip elektroforézy a denzitometrie lze najít v učebnicích klinické biochemie nebo instrumentální techniky imunoglobuliny - lze zachytit pouze hrubé změny: hypergamaglobulinémii, hypogamaglobulinemii či monoklonální gamapatie Elektroforéza sérové proteiny mohou být elektroforeticky separovány Klasická elektroforéza - screening ↓ ↑ ↑ ↑ Nevýhoda – detekce pouze velkých změn v proteinových frakcích Zánět Hypergamaglobulinemie (monoklonální gamapatie) Hypogamaglobulinemie ↓ ↓ ↑↑ Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html Elektroforéza Příklady elektroforetického rozdělení řady pacientských sér Ohraničený band v γ- globulinové oblasti = pacienti k dovyšetření imunofixací Využití elektroforézy v klinické praxi screening chorobných stavů • Vyšetřovaný materiál: sérum, moč, likvor Hyperproteinémie – hypergamaglobulinemie je vzácná: • Zánět • monoklonální gamapatie (v moči – Bence-Jonesova bílkovina) • chronické dlouhotrvající infekce, např. AIDS (zvýšená syntéza imunoglobulinů) • Některé autoimunitní onemocnění – např. Sjögrenův syndrom Hypoproteinémie - většina chorobných stavů: • porucha syntézy bílkovin v játrech • nadměrné ztráty – nefrotický syndrom (vyšetření moči – zvýšené koncentrace bílkovin) • poruchy výživy – malnutrice • poruchy trávicího traktu – maldigesce a malabsorpce – nespecifické střevní záněty (Crohnova choroba, ulcerózní kolitida) • Rozsáhlé popáleniny • Hyperhydratace – dochází k naředění bílkovin séra – těhotenství (fyziologicky), nevhodně podaná infuze Elektroforetické frakce obsahují tyto plazmatické proteiny Elektroforetické frakce obsahují tyto plazmatické proteiny Využití elektroforézy v klinické praxi screening chorobných stavů • Izoelektrická fokusace: kvalitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů • Vyšetřovaný materiál: Likvor (CSF) + sérum (S) současně • Intratékální syntéza protilátek v centrálním nervovém systému pochází z perivaskulárních infiltrátů B lymfocytů, které lokálně proliferují, dozrávají v plazmocyty a produkují příslušné protilátky • Diagnostika roztroušené sklerózy – průkaz oligoklonálních pásů v likvoru (pozitivita až v 98% případů) • Obrázek vpravo: oligoklonální pásy jsou přítomny pouze v likvoru (CSF), zatímco v séru chybí – jedná se o intratékální syntézu Ig – tento nález je pro roztroušenou sklerózu poměrně typický Modifikace elektroforézy - Imunofixace • Použití: • Identifikace paraproteinu- sérum, moč a likvor • paraprotein = monoklonální imunoglobulin • produkován 1 klonem B-lymfocytů • stav, kdy má pacient v séru paraprotein se nazývá paraproteinémie nebo též monoklonální gamapatie Monoklonální gamapatie • Onemocnění s výskytem monoklonálního imunoglobulinu v séru • Monoklonální gamapatie nejasného významu (MGUS) • Mnohočetný myelom • Plazmocytom • Waldenströmova makroglobulinemie • AL amyloidóza • Nemoci těžkých řetězců • Imunofixace slouží k: • Diferenciální diagnostice gamapatie • Sledování vývoje onemocnění v čase • Sledování terapie • Vyšetření séra + moči současně!! Imunofixace - zpracování Na agarózový gel se na pozici start nanesou pomocí šablony séra pacientů (1 pacient = 6 drah) Šablona = umělohmotný proužek s vyřezanými tvory který se přiloží na vyznačené místo na gelu pro start Start – místo přiložení šablony Agarózový gel před elektroforetickým rozdělením Agarózový gel po elektroforetickém rozdělení Na agarózový gel se po elektroforetickém rozdělení vzorků séra se přiloží maska - umělohmotná fólie s vyřezanými otvory tak, aby se na jednotlivé linie dalo aplikovat příslušné antisérum Vyřezaný otvor Maska Při inkubaci s monospecifickými antiséry dochází k jejich vazbě na příslušné molekuly imunoglobulinů a dochází k precipitaci Po uplynutí inkubační doby se celý gel zahřeje na 60°C, čímž dojde k denaturaci vzniklých precipitátů a jejich přilnutí k podkladové membráně gelu. • Pro vyhodnocení se provádí barvení imunofixovaných vzorků a poté jejich vyhodnocení. • Pokud vyšetřované sérum nebo moč pacienta obsahují zmnožený jeden klon imunoglobulinů nebo jen jejich část – κ nebo λ řetězce - vytvoří se ohraničený proužek tzv. band (paraprotein) • Při vyhodnocování platí pravidlo, že band –paraprotein- v původním elektroforetickém rozdělení musí mít ve všech pruzích stejnou polohu ve vzdálenosti od startu. Stejná poloha paraprotienu vzhledem ke startu Imunofixace – odečítání výsledků Polyklonální Ig – zdravý člověk Pacient s paraproteinem IgG λ a lehkými řetězci λ Pacient s paraproteinem IgA κ Imunofixace – odečítání výsledků Pacient s paraproteinem IgM λ Pacient s paraproteinem IgM κ MOČ Volné lehké řetězce λ Biklonální gamapatie IgG κ + IgM λ Modifikace elektroforézy reakcí Ag-Ab • Zvýšenou (i sníženou) koncentraci gamaglobulinů je nutno vždy dále došetřit • Metody kvalitativní • Imunolektroforéza (dle Graba a Williamse) • Protisměrná elektroforéza • Metody kvantitativní • Raketková imunoelektroforéza (dle Laurella) • Dvourozměrná elektroforéza Tyto metody jsou v dnešní době zastaralé a využívají se pouze výzkumně (pocházejí z dob, kdy nebyl znám proces výroby monoklonálních protilátek a používala se tedy pouze polyklonální směsná antiséra) Pozn. Pro účely zkoušky je třeba důkladně znát klasickou elektroforézu, imunofixaci a imunoblot, ostatní metody jsou rozšířením znalostí. Imunoelektroforéza • 2 fáze: 1) Rozdělení proteinů klasickou ELFO 2) Aplikace polyspecifického antiséra do podélně vykrojeného žlábku v gelu  difuze do gelu • V místě ekvivalentní koncentrace obou složek se vytvoří obloukovitá precipitační linie Imunoelektroforeogram normálního lidského séra • Použito polyspecifické antisérum  až 35 precipitačních obloučků (každý oblouček = 1 protein) • Obloučky mají charakteristický tvar a umístění na imunoelektroforeogramu vzorek vzorek Imunoelektroforegram normálního lidského séra: žlábek a polyspecifické antisérum proti lidským sérovým proteinům žlábek b monospecifické antisérum anti - IgG žlábek c monospecifické antisérum anti - IgM žlábek d monospecifické antisérum anti - IgA http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/8.%20Imunoelektroforeza.pdf Nevýhody: • Okometrické odečítání • Výsledky pouze kvalitativní • Nutná zkušenost odečítajícího – různé monografie, atlasy Protisměrná elektroforéza • Imunodifuze urychlená el. polem (výsledek za 30 min) • Využívá opačných pohybů Ag a Ab v el. poli • 2 jamky • Jedna blíže anodě – pipetujeme protilátku • Druhá blíže katodě – pipetujeme antigen • V el. poli se bude antigen pohybovat k anodě a protilátka ke katodě  v místě ekvivalentní koncentrace obou složek se tvoří precipitát • Kvalitativní průkaz antigenů s anodickou pohyblivostí Raketková imunoelektroforéza • Umožňuje kvantitativní hodnocení, citlivost od 0,1 mg/l • Imunodifuze probíhající v el.poli • Rozdíl od předchozí metody – protilátka (antisérum) se přimíchá do agarózového gelu • Migrace proteinů – střetávají se s molekulami protilátky v gelu – v místě ekvivalentní koncentrace obou složek se tvoří precipitát • Díky pohybu proteinů získává tvar píku – „raketky“ Raketková imunoelektroforéza Dvourozměrná (2D) elektroforéza Dvourozměrná (2D) elektroforéza • Kombinace elektroforézy s raketkovou imunoelektroforézou • Krok 1: klasická elektroforéza séra • Krok 2: Po ELFO slouží gel s rozdělenými proteiny jako start elektroimunodifuze – gel se otočí kolmo a k němu se doplní nový gel (obsahující polyvalentní antisérum)  elektroimunodifuze probíhá ve směru kolmém na gel se separovanými proteiny • Vznik píků, jejichž plocha / výška je úměrná koncentraci daného proteinu • Poloha píku charakterizuje druh antigenu • Lidské sérum – touto metodou lze stanovit až 50 různých proteinů