ELISPOT
TEREZIE PLUCAROVÁ
princip
V jamce destičky monoklonální ab proti
detekované látce (kautuje výrobce či laboratoř)
Do jamek buněčná suspenze
(stimulované/nestimulované buňky)
Inkubace (zachycení produktů na ab)
Odmytí buněk a přebytečných produktů
Vizualizace: ab značená enzymem-substrát
◦ Odmývání přebytků jednotlivých složek
◦ Zastavení reakce: proplach kohoutkovou vodou
ELISpot reader (scanování desky, počítání spotů)
Na dně destičky je membrána
Stimulace: př. LPS, CMV, ethanol; preinkubace se
stimulanciem/smíchat až v jamce ELISPOT desky
detekce
Enzymatická: křenová peroxidáza,
biotinylovaná ab-streptavidin-ALP
Fluorospot: fluorescenční detekce
spotů
Double-color: detekce dvou různých
produktů v jedné jamce, každý
produkt značen jinou barvou
double-color vs single-color
fluorospot
využití
Sledování produkce protilátek (Blymf)
či cytokinů (T a B lymf)
Příklad: detekce IL-10 a IFNγ T-lymf
◦ Monitoring zánětlivé odpovědi (IFNγ
prozánětlivý, IL-10 protizánětlivý)
◦ Přesmyk T-lymf z produkce IFNγ na IL-10
◦ U pacientů s astmatem porušena regulace
této dráhy – nadprodukce IFNγ – klinické
příznaky
◦ Vitamin D podporuje přesmyk T-lymf na
produkci IL-10 – u některých pacientů
zlepšení klinického obrazu
Děkuji za pozornost