Průtoková cytometrie
Stanovení lymfocytárních populací
Materiál:
• Plná krev (EDTA)
• Monoklonální protilátky CD45 FITC, CD3 FITC, CD14PE, CD4 PE, CD16+56 PE, CD8 PC5 a CD19 PC7
• Lyzační roztoky A, B a C
Postup:
1) Pro vyšetření každého vzorku si připravte 3 FACS zkumavky (světle modrá barva)
2) Zkumavky popište – název vzorku + číslo zkumavky
3) Do jednotlivých zkumavek napipetujte monoklonální protilátky dle tabulky:
FITC (5ul) PE (5ul) PC5 (5ul) PC7 (4ul)
Zkumavka 1 CD45 CD14 X X
Zkumavka 2 CD3 CD4 CD8 X
Zkumavka 3 CD3 CD16+56 X CD19
4) Odběrovou zkumavku s krví před zahájením práce opatrně promíchejte – stačí 2krát převrátit
5) Opatrně odšroubujte víčko odběrové zkumavky a do FACS zkumavek s monoklonálními protilátkami
pipetujte 45ul plné krve → při pipetování dbejte na to, aby stěny zkumavek nebyly potřísněny krví –
v opačném případě krev ze stěn co nejdříve setřete pomocí vatové tyčinky
6) Zkumavky s krví a monoklonálními protilátkami inkubujte 30 min ve tmě při laboratorní teplotě
7) V průběhu inkubace:
• Pro stanovení počtu leukocytů odběrovou zkumavku EDTA s krví umístěte na třepačku v laboratoři
(cca 3 min)
• Poté v plné krvi změřte absolutní počet leukocytů na analyzátoru Mythic a hodnotu si zapište – bude
třeba pro výpočty
8) Po uplynutí inkubace FACS zkumavky vložte do automatického lyzátoru TQ-prep a lyzujte erytrocyty
9) Po lýze uchovávejte zkumavky v lednici do doby měření
10) Změřte vzorky na průtokovém cytometru Navios – protokol „STUDENTI NOVE“
Hodnocení:
Krevní diferenciál Fyziologické
rozmezí u osob
starších 18 let
Leukocyty 4-10 x10^9/l
Lymfocyty 20-45 %
Monocyty 2-12 %
Granulocyty 48-83 %
Eozinofily 0-8 %
Bazofily 0-1 %
T lymfocyty 55-83 %
Th lymfocyty CD4+ 28-57 %
Tc lymfocyty CD8+ 10-39 %
B lymfocyty CD19+ 6-19 %
NK buňky CD16/56+ 7-31 %
Monocyty CD14+HLA-DR+ 90-100 %
Hodnotí se procentuální zastoupení
lymfocytárních populací ve vzorku, tj
Celkové T-lymfocyty: CD3+: 70%
Pomocné T-lymf.: CD3+CD4+: 40%
Cytotoxické T-lymf.: CD3+CD4+: 28%
B-lymfocyty: CD19+: 20%
NK-buňky: CD16,56+: 10%
Z takto získaných hodnot a z naměřeného
počtu leukocytů se pak vypočítají absolutní
počty jednotlivých typů lymfocytů v 1l
periferní krve. – viz další strany
Hodnocení dat z průtokového cytometru:
1) Dot Plot: Forward Scatter (FSC) vs Side Scatter (SSC)
2) Dot Plot: CD znaky značené fluorescenčními barvami
• ve směru doprava a nahoru roste pozitivita pro daný znak
• Hodnotí se jasně definovaná populace buněk → tvoří dobře definovaný „shluk“ a minimální počet
buněk v jedné populaci musí být >300
CD3-CD4+ CD3+CD4+: 40%
CD3+CD4-:30%CD3-CD4-
CD3-CD8+
CD3+CD8+. 28%
CD3+CD8-:42%
CD3-CD8-
+
++
+++
+ ++ +++
Tyto buňky jsou silně
pozitivní pro CD3 i CD4,
jedná se o Th lymfocyty
Tyto buňky jsou silně
pozitivní pro CD3 i CD8,
jedná se o Tc lymfocyty
CD3 negativní CD19 pozitivní
buňky = B lymfocyty
CD3 pozitivní CD19 negativní
buňky = T lymfocyty
CD3-CD19+:20%
CD3-CD19: 9%
CD3+CD19-:70%
20%
10%
Výpočet absolutního počtu lymfocytů - příklad
Naměřený počet leukocytů v krvi pacienta: 5x10*9 leukocytů v 1litru periferní krve.
Z cytometrické analýzy vyplývá, že pacient má 20 % lymfocytů a 10 % monocytů.
Výpočet procenta granulocytů: 100-(20+10)=70
Granulocyty tvoří 70 % ze všech leukocytů:
Výpočet absolutního počtu lymfocytů:
100% leukocytů ........................... 5x10*9
20% lymfocytů……………………………x
X=(20* 5x10*9)/100 = 1x10*9
Pacient má 1x10*9 lymfocytů v 1l krve.
Výpočet absolutního počtu celkových T-lymfocytů:
V krvi pacienta bylo naměřeno 70% T-lymfocytů:
Výpočet:
100% ...........................1x10*9
70% T-lymfocytů……….x
x= (70*1x10*9)/100 = 0,7x10*9
Pacient má 0,7x10*9/l celkových T-lymfocytů.
Výpočet absolutního počtu pomocných (CD3+CD4+) T-lymfocytů:
V krvi pacienta bylo naměřeno 40 % pomocných T-lymfocytů:
Výpočet:
100% .......................................1x10*9
40% CD3+4+T-lymfocytů……….x
x= (40*1x10*9)/100 = 0,4x10*9
Pacient má 0,4x10*9/l pomocných T-lymfocytů.
Vypočti absolutní počet cytotoxických T-lymfocytů, B-lymfocytů a NK buněk:
Výsledky měření:
Celkové T-lymfocyty: CD3+: 70%
Pomocné T-lymf.: CD3+CD4+: 40%
Cytotoxické T-lymf.: CD3+CD4+: 28%
B-lymfocyty: CD19+: 20%
NK-buňky: CD16,56+: 10%
Počet leukocytů: 5x10*9/l.
20% lymfocytů
10% monocytů