HUNI MED Genetika v zubním lékařství - cvičení 1 Ing. Hana Holcova Polanská, Ph.D. Mgr. Lucie Válková Johann Gregor Mendel • 20. 7. 1822, Hynčice t 6. 1. 1884, Brno • Zakladatel genetiky • Objevitel základních zákonů dědičnosti • Zákon o uniformitě Fl generace • Zákon o náhodné segregaci genů do gamet • Zákon o nezávislé kombinovatelnosti alel semeno květ lusk stonek tvar dělohy barva tvar barva umístění velikost • CO Q ■ta? šedý S kulatý žluté bílá plný žlutý lusky a květy podél stonku dlouhý ffl £? m bílý a svrasklý zelené fialová přiškrcený zelený koncové lusky, vrcholový květ krátký 3 5 6 7 Pokusy s rostlinnými hybridy (1866) Základní pojmy * Genetika • obor zabývající dědičností a variabilitou kvantitativních a kvalitativních znaků všech živých organismů • Gen • základní jednotka dědičnosti (genetické informace) • konkrétní úsek molekuly DNA, který nese informaci pro tvorbu bílkoviny nebo nukleové kyseliny • skládá se z exonů a intronů strukturní funkční | ^ Exon DNA ]Ni^gMíí6^^T^>íiíÄÍL^ Intron Exon Intron Intron Exon Intron Exon Exon RNA Intron ÉMn Intron EKOn Intron Exon Intron E*on Základní pojmy • Chromozom • funkční celek dědičného záznamu genetické informace v buňce • jádro buňky —► 22 párů autozomů + 1 pár gonozomů * Lokus • umístění genu na určitém místě na konkrétním chromozomu • Alela • konkrétní forma genu Chromosome Nucleus Chromatid Chromatid Image adapted from: National Human Genome Research Institute. Základní pojmy • Genomika • obor genetiky, který se snaží stanovit úplnou genetickou informaci organismu a interpretovat ji v termínech životních pochodů Heterozygot • dvě různé varianty (alely) daného genu nebo jeho části Homozygot • dvě stejné varianty (alely) daného genu nebo jeho části Dominant Recessiv Dominant homozygot homozygot heterozygot B B b b B Základní pojmy Polymorfismus • existence několika (přinejmenším dvou) alel pro daný gen, z nichž nejméně častá má populační frekvenci alespoň > 1% Mutace • procesy, při kterých dochází ke změnám v genotypu v důsledku působení různých faktorů prostředí • méně častá alela má populační frekvencí < 1% DNA vs. RNA molekula DNA = kyselina deoxyribonukleová - Dvoušroubovice - 2 řetězce v opačném směru - Polynukleotidový řetězec • Dusíkatá báze ( X A, C, G) spojená vodíkovými můstky • Zbytek kyseliny fosforečné • Cukerná složka - deoxyribóza molekula RNA = kyselina ribonukleová - jednovláknová - Polynukleotidový řetězec • Dusíkatá báze ( U, A, C, G) spojená vodíkovými můstky • Zbytek kyseliny fosforečné • Cukerná složka -ribóza - Typy-mRNA, tRNA, rRNA e, o o °e 0' o O^P ll o ■ Tfrymtn* 1 Cytosine H ľ H^^i, Adenine w « >^rf^*-rn Guanine O pentose Base nucleoside--nucleotide-- glycosidic bond ■■nucleoside diphosphate-nucleoside triphosphate- H CytMins Adenine CO H n-_^*a^nh Guanine hutelotwses úf DNA DNA Dewy ribonucleic Acid RNA RiponMClfk Acid NucflotHses Df RNA Ústřední dogma molekulární biologie Jádro Cytoplazma - ribozomy / Replikace \ í (syntéza DNA) ) / DNA ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ ■■■■■■■■ ■■■■■■■■■■■■i Transkripce (syntéza RNA) RNA Translace (syntéza proteinu) PROTEIN < > < XXX » ^<>- aminokyseliny Replikace DNA = tvorba kopií molekul DNA zajišťující přenos genetické informace z mateřské do dceřiné buňky • S-fáze buněčného cyklu • semikonzervativní proces - 1 nové + 1 staré vlákno • Složky potřebné pro replikaci • templát - mateřské vlákno • primer - krátký oligonukleotid s volným 3'OH koncem • enzymy • nukleotidy Replikace DNA Vznik replikační vidlice • helikáza - umožňuje oddálit obě molekuly dvojšroubovice • SSB proteiny - napomáhají udržet vlákna rozdělená DNA primáza - tvorba RNA primerů Replikace je zahájena ve specifických místech -počátcích replikace („origins") DNA polymeráza - katalyzuje prodlužování řetězce • sekvence nového vlákna dle principu komplemetarity bází - adenin + thymin (2 vodíkové můstky) a cytosin + guanin (3 vodíkové můstky) • syntéza od 5' konce ke 3' konci 5' 3' Vedoucí řetězec Nově syntetizovaný řetězec Nový Okazakiho RNA-primer et1t \ dl Svírací protein DNA-polymerasa Rodičovská DNA Primasa 5' DNA-helikasa "Vazebný protein pro udržení jednořetězcové struktury DNA 5' / Váznoucí řetězec Okazakiho fragment Replikace DNA • Templátová vlákna antiparalelní-jeden řetězec opožděn • Vedoucí řetězec - jeden RNA primer na začátku, replikace probíhá bez přerušení • Opožďující se řetězec - ve směru 5'- 3' se diskontinuitné tvoří krátké Okazakiho fragmenty (každý z nového RNA primem), které se následně spojí DNA ligáza • RNA primery jsou odstraněny 5'-3'exonukleázovou a nahrazeny 3'-5'polymerázovou aktivitou Transkripce • přepis informace v podobě sekvence DNA do sekvence RNA • jádro buňky • templát - vlákno DNA • Transkripty se z templátu uvolňují jako jednořetězce • DNA-dependentní RNA polymeráza • 3 typy (strukturně podobné, přepisují různé typy genů) • RNA pol. I (geny kódující rRNA) • RNA pol. II (geny kódující hnRNA) • RNA pol. III (geny kódující tRNA) • vyžaduje přítomnost transkripčních faktorů (rozvolnění řetězců DNA, umístění RNA polymerázy. na promotor a uvolnění z promotoru) • Promotor = startovací místo na DNA - TATA box, CAT box • Terminátor = koncové místo - AAAA Posttranskripční modifikace • Modifikace primárních transkriptů: • Připojení čepičky na 5'konec (podílí se na řízení translace mRNA) Obrázek 3 - Struktura tzv. RNA čepičky li.' h2u n 0 0 0 11 11 11 „ i—o-P-O-P-O-P-0—i „ Basel o- o- i- \°y 0 ov 1 CH, 0=P-0" w OH OH 7-methylguanosine • Připojení polyadenylačního řetězce na 3'konec • Sestřih (splicing) RNA - vystřižení intronů za vzniku zralé mRNA Start of transcription Gene: Primary transcript: Mature transcnpt: Intron 1 Intron 2 Exonl Exon2 Exon3 Transcription Intron 1 Intron 2 Exonl \/ Exon2 \/Exon 3 Splicing Exon 1 Exon 2 Exon 3 Translace • Překlad genetické informace z mRNA do sekvence AMK v polypeptidu (pomocí genetického kódu) • Probíhá na ribozomy v cytoplazmě buňky • Fáze - iniciace, elongace, terminace • Enzym - Aminoacyl-tRNA syntetáza • Iniciační komplex se tvoří na 5'konci mRNA (čepička), zkoumá mRNA od 5'konce a hledá iniciační kodon AUG • Terminace translace: UAA, UAG, UGA • Postranslační úpravy - fosforylace, glykosylace, metylace,.... řetězením aminokyselin vzniká bQkovina volné aminokyseliny- aMkodón^^^^ 3 O tRNA nesoucí C volná tRNA aminokyselinu mRNA ribozom kodony sraer posunu nbozómu juuuinjuuiíym —" ĹľZi kodón Genetický kód • Systém, podle kterého se přiřazují specifické AM K do polypeptidového řetězce podle sekvence mRNA • Triplet = kodon - definuje AMK nebo terminaci translace • Každá AMK určena jedním nebo několika kodony v mRNA • 64 možných tripletů: 61 určuje AMK, 3 určují terminaci translace • Kodony jsou rozeznávány komplementárními sekvencemi v tRNA (antikodony), které nesou na 3'konci specifické AMK Inzerce/delece jednoho/dvou párů bází mění čtecí rámec (Téměř) univerzální, degenerovaný druhý nukleotid | prvý nukleotid c A G -f ä 3 C t~ ra o -* a £ fenylalanín A ^ leucín c CC senn CA CG A ^ A C tyrozm A A koniec A G koniec q £ cystein G A koniec G G tiyplofán C c C C leucín C A C G CC C C C pr0|ln CCA C CG CA .. .... CAC h,s,""n ^ gl u ta mín CAG CG CGC arain(n CCA CG G C A A A C isoleucín A A A G začiatok AC A CC Leonin ACA ACG AAC^ AAA lyjjn AAG AG AGC sen" AGA w arginín AG G A G G G C .. G A ra,,n G G GC $ CC „tanín G CA G CG G A kys. G A C G A Akys CAG glutamová GG GGC glycín GGA GGG G Genetický kód - změna čtecího rámce A single base-pair delation rastoras the reading frame changed by a single base-pair addition. DNA ATG TTT CCC AAA GGG TTT.....CCC TAG (Wild-typeallele) yAC £_Aj^ GGG T_T_T £C£ £Aj^ ztráta genetické informace min. u jedné buňky • dvojnásobná replikace před mitózou -> zvýšený počet kopií genů na příslušné části chromozomu -> nerovnováha v genové expresi, nízká viabilita Buněčný cyklus • řídící elementy - cyklin dependentní kinasy • řídí aktivitu mnoha proteinů zapojených do replikace DNA a mitózy tím, že je ve specifických místech fosforylují (aktivace/inaktivace) • Cyklin + CDK -> komplex se připojí na protein -> fosforylace proteinu -> po fosforylaci se komplex rozpadne a dojde ke změně aktivity proteinu cyclin Cdk-activating kinase (CAK) Cdk active site activating phosphate (A) INACTIVE (B) PARTLY ACTIVE (C) FULLY ACTIVE Buněčný cyklus - Interfáze Interfáze-G1,G2, S • příprava na buněčné dělení, vnější jaderná membrána je spojená s ER * nepříznivé podmínky • setrvání v Gl/vstup do GO; buňky nerostou, mohou tak setrvat i několik měsíců/let G2-fáze • dvojnásobné množství DNA (než v Gl) • syntéza proteinů potřebných na vstup do mitózy Gap 2 S-fáze replikace DNA syntéza proteinů asociovaných s DNA Gap 1 DNA synthesis GO-fáze • většina buněk mnohobuněčných organismů (jsou diferencované a specializované k výkonu určité funkce, nedělí se) • po přijetí prorůstového faktoru mohou vstoupit zpět do buněčného cyklu Gl-fáze • nejdelší a nejvariabilnější • buňka se zvětšuje a zdvojuje organely • na konci této fáze se nachází kontrolní bod: bod restrikce • buňka má dostatek živin a růstových faktorů, vykazuje vysokou metabolickou aktivitu -> přejde bod restrikce a pokračuje do další fáze • nedostatek živin, obdržení antiproliferačního signálu -> zpomalení postupu fází/opuštění cyklu (přechod do GO) Buněčný cyklus - Mitóza • jaderné dělení (mitóza) + následné dělení cytoplazmy = cytokineze Mitóza • dělení somatických buněk • vznik - dvě diploidní buňky s identickou genetickou výbavou • profáze - spiralizace vláken DNA, tvorba mitotického vřeténka • prometafáze - rozpad jaderné membrány • metafáze - sestavení kinetochoru na každé centromere, připojení chromatid k vřeténku ( ekvatoriální rovině) • anafáze - separace chromatid k opačným pólům • telofáze - dokončení separace chromatid, rozložení vřeténka, obnovení jaderné membrány Prophase Metaphase Anaphase Cytokinesis Mitóza vs. meióza paternal homolog maternal homolog fr ( DNA REPLICATION DNA REPLICATION ( fr PAIRING OF DUPLICATED HOMOLOGOUS CHROMOSOMES BIVALENTS LINE UP ON THE SPINDLE DUPLICATED CHROMOSOMES LINE UP INDIVIDUALLY ON THE SPINDLE CELL DIVISION DIOIOIOMJIO Mitóza = 2 dceřiné buňky s diploidním počtem chromozomů; 1 cyklus DNA replikace, následuje rozdělení chromozomů a jádra (profáze —» prometafáze —» metafáze —» anafáze —» telofáze) a násl. celé buňky (cytokineze) Meióza = 1 cyklus replikace následován 2 cykly segregace chromozomů a buněčného dělení, vznik haploidních gamet 1. meiotické (redukční) dělení - rozdělení homologních chromozomů; odehrává se zde meiotický crossing-over (rekombinace genů) - žádná z gamet není identická! Poruchy rozestupu - např. trisomie. 2. meiotické dělení - rozestup sesterských chromatid -> 2 dceřiné buňky s haploidním počtem chromozomů, vznik pohlavních buněk (spermie, vajíčko), dodatečné promíchání genetického materiálu crossing-overem gametes Meióza • vznik 4 haploidních gamet (pohlavní buňky) • genetická variabilita Heterotvpické dělení • Profáze - 5 částí • Leptotene - spiralizace chromozomů • Zygotene - vznik bivalentů • Pachytene - crossing over = křížení nesesterských chromatid • Diplotene - postupné rozestoupení homologních chromozomů • Diakineze - rozpuštění jaderného obalu, vznik dělícího vřeténka • Metafáze - vzniká ekvatoriální rovina • Anafáze - rozdělení 2n chromozomů, oddálení vřeténka • Telofáze-vytvoření jaderného obalu, zánik vřeténka MEIOZA - heterotypické dělení PROFÁZE P^ry Pomologických _ chromozomu - vznik bivalentu ^ crossing over rozpustení jaderné membrány METAFÁZE ANAFÁZE výmena dásti chromatid TELOFÁZE « vznik dělicího aparátu rozestoupeni chromozomu a jejich redukce z 2n na 1 n vznik jaderných membrán dcefinných buněk 1 ■C http://www.szes-la.cz/ Meióza Homeotvpické dělení • Profáze - spiralizace chromozomů, vznik dělícího vřeténka, rozpuštění jaderné membrány • Metafáze - vzniká ekvatoriální rovina, připojení na dělící vřeténko • Anafáze - oddalování chromatid rozdělených chromozomů • Telofáze - vytvoření jaderné membrány, zánik dělícího vřeténka, despirilizace chromozomů _ MEIOZA - homeotypické dělení http://www.szes-la.cz/ Mutace Mutace jsou dědičné změny na úrovni genetického materiálu, které se projevují ve změně primární struktury nukleové kyseliny, tj. změně v sekvenci nukleotidů. Souvisí se změnou genotypu, ale nemusí se projevit i fenotypově. • Význam mutací: • Pozitivní-zdroj dědičné variability, význam pro evoluci • Negativní - hromadění vadných genů, vznik geneticky podmíněných onemocnění, tvorba nádorů • Neutrální • Klasifikace mutací: • spontánní (chyby při replikaci) x indukované (mutageny) • gametické x somatické • dominantní x recesivní (1:100) • přímé x zpětné (mutovaný genotyp se zpětně mění na původní genotyp) • vitální x letální • jaderné x mimojaderné (mt, cp) • genové x chromozómové (strukturní CHA) x genomové (numerické CHA, aneuploidie, Polyploidie) Genové mutace Genové (bodové) mutace • substituce bazí (tranzice, transverze) - standardní alela -> mutantní alela -> změněný protein • delece/inzerce bazí (změna čtecího rámce) Důsledky bodových mutací: • mutace měnící smysl kodonu (jiná AMK) • nesmyslné mutace (stop kodon) • silent mutace (jiný kodon, stejná AMK) Normální » -r- —r- —r— T" c a t •t c a c c t g t a c c A: g t a ■ a g T g g a c a t _i_ g _i_ g t; Substituce c a g t g c c G a T c c t g g a g c —- a: c c T i G G • Srpkovitá anémie - AR dědičnost; substituce CTC -> CAC v beta řetězci (záměna kys. glutamové za valin); rezistence vůči malárii (infekci plazmodiem) - heterozygotní výhoda (selekční výhoda oproti oběma homozygotům) Deteoe \ c a t g t a i-1-r cac g t g — C -i-r t g g a c -:-1-r- a c : c a a t g • g inzerce i i i c a t g t a g t c c a g TET t g g t é Ť a c a a i c g -r-g c __ Chromozómové mutace Strukturní chromozómové aberace jsou důsledkem jednoho nebo několika zlomů v DNA. Klasifikace: • balancované (zachováno původní množství genetického materiálu) • translokace - např. Philadelfský chromozom t(9;22) u CML • inverze • inzerce • nebalancované (část genetického materiálu chybí či přebývá) • duplikace • delece •Cri du chat (delece na krátkém raménku chr. 5) • Prader-Willyho syndrom (delece paternálního chr. 15) • Angelmanův syndrom (delece maternálního chr. 15) • izochromozom • ring chromozom M íl 46,XX,del(5)(pl4.1) i( U H ÍV ti II flj Genomové mutace * Aneuploidie pohlavních chromozomů • Turnérův syndrom 45, X • Klinefelterův syndrom 47, XXY • XXX syndrom • XYY syndrom *Aneuploidie somatických chromozomů • Downův syndrom (21) • Edwardsův syndrom (18) • Patauův syndrom (13) * Polyploidie • mezi obratlovci vzácná, častější u rostlin K i! A IV Karyotype from a female with Patau syndrome (47,XX,+13) 1 2 3 4 5 M )( 11 : ! Ii 1 }\ -:; • - r 6 7 8 9 10 11 « -i ■ \i /i » i| : ; ■ . * * • ■ ■ i 13 14 15 16 17 18 - 9 > • ( l/s 19 20 21 22 V V.XX Y M Ü II li 12 if B *■ 6 7 ??? 4V V 13 l^14 15 19 20 wy 1:4 2:4 2;4 1:4 * _> Praktická část cvičení PCR - Polymerase Chain Reaction • Cíl - získání požadované a specifické sekvence genomové DNA bez jejího předchozího klonování • Princip - mnohonásobná replikace • cca 30 cyklů • závislost na teplotě reakční směsi • množství namnožené DNA roste exponenciální řadou (2n) • Termocycler 1st cycle — ;;;;;i;;;;;;i;rmr lllllllllllllllllll 22 = 4 copies 2nd cycle - llllliililllllliiri iiiiiiiiiiiiiiljlil lil............Hg iiiniiiiiiiiiinn 23 = 8 copies 3rd cycle TfTTTTT 4th cycle um rrrmr illiillillUMTTTTT """"in...... """"""""'" iiiiiiiiiiiiiiiiin iiiiiiiiiiiinnni ľiiiľiiľiiiľľi 24 = 16 copies !!!!!!!!!!! mini 1IU1UU1I mini mumm i"»»i mmmmmtm llDlllllllllllllll lllllllllllllllllll .........."i""" 1111II111111!(M! If mmzmi mnu iiii'i'i'ii mini rrrmi iiiiiiiiiiiiiiiiin lllllllllllllllllll iiiiiiiiiiiiiiiiin iiiiiiiiiiiiiiiiin im..........um 2s = 32 copies -► 30th cycle 231 = 2 billion copies Exponential Amplification Process is repeated, and the region of interest is amplified exponentially saidoD ii m £ \|;i.'MU.HH\i\ ' pdL}j|duiu puc 'paicadaj si SS930Jd UOI)E31)l|dlUV |EjlU3Uodx3 S3ldo3 Ui il||m 1 = ift mm: nmn imm jmm 1TI1I1I min..... III!!!! lülülllll lllllllllll rnrni l'l'l'l'l'l TTITITI ssidoa gl = niiiiiiiiiiiiiim iiiiiiiiiii ............... iiiimiii iiiiiiiiiiniiii ........... mmmimmm liiiüiiiiiiiiiirji S3ldCD 8 = (z lllllllllllllllllll iiiiliiiiiiiiiiim lililll...........I — Spi3 puz soidoD f = i:ii:iiiiiiiiii;in t pucjis VNÜ 1U03SBU UUOJ Ol j.-uuud spuaixa asejsui \]o(| , ^vs i j i M, i i )i ! ] ! ! i i i i x tj^-U.u.x-ij.MJ i i i i i rmi «rr-T>Tr-TT7-.c > spucjis VNO lurosEjM uoisusixH c I I I I I I II I jJU I I I I I I I sjo uoiSa}] spuoj|S vnq /asu sozisoqiuXs 3SojsujA-|0,j (s OC 'D„f/6) spuDJis VNQ 3j0J0d9S 0| OinjD'JBQ spuoip VNO O) puiq sjaiuijfj spuoj|s VNO »Itwbdas 0| o|dmos VNQ sjnjousQ Do ZL - VNQ eu>|e|a ouaAOu ezajuÄs - a3eSuo|a -Do S9-0S - ruaiuud jubzgabu - §u||eauue -Do 96 - (VNQSP 93BJedas) aoejnieuap - :n|>|ÄD jueAO>|edo 8DB>|!|d8J vno z pjfazeipÄA 8D>|B8j BAOzajay 9DABUJn>|Z 3A 9DB>|!|d9J OJ}}A UI BUqOSBUOl]OU|AJ PCR DNA replikace - in vitro (PCR) • templátová DNA ^> % • dNTP Trnrrn ^ • pufr(pH=8) • Mg2+ ionty 1......6 [ . ľ iHTtrTTl Nucleotides Vic? ~^***/ Toq DNA • Ovlivňují aktivitu a přesnost polymerázy primer • krátké specifické úseky DNA • oligonukleotid 20-25 pb • ohraničení oblasti amplifikace DNA DNA polymeráza • termostabilní (odolává teplotám až 98 °C) • Taq [Thermus oquoticus), Tth [Thermus thermophilus) teplota DNA replikace - in vivo • enzymy - helikáza, primáza, DNA polymeráza, ligáza ... DNA replication DNA polymerase \ Original DNA