u r j i ED Genetika v zubním lékařství - cvičení 2 Metody molekulární biologie Ing. Hana Holcova Polanská, Ph.D. Mgr. Lucie Válková Biologický materiál • Biologický materiál je vše, co bylo či je součástí nebo produktem živého organismu. - sušená bylinná čajová směs - ohryzek od jablka - dubové prkno - kočičí trus/srst - zkumavka s virem SARS-CoV-2 - tělní tekutiny - moč, krev, plazma, sérum, sliny, ejakulát, hlen - tkáně, buňky___ Izolace nukleových kyselin • V nativním stavu z přirozeného materiálu - v dostatečném množství a požadované čistotě. • N K je potřeba zbavit všech látek, které se po lyži buněk stávají součástí hrubého lyzátu a jejichž přítomnost by bránila účinnému specifickému působení enzymů používaných k dalším analýzám. HornegenizatKin Lysis Separation Precipitation • Izolace genomové DNA • Izolace RNA - důraz na ochranu před degradací! Homogenization/ Phase Extraction/ Lysis Separation Precipitation Resuspension Gelová elektroforéza - agarózová • agarózová (produkt mořských řas - agar)/polyakrylamidová • Separační metoda využívaná při izolaci a analýze NK (a proteinů = polyakrylamidová elfo) • Princip: pohyb nabitých molekul ve stejnosměrném elektrickém poli (separace molekul o rozdílné molekulové hmotnosti) • Rychlost pohybu je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku • DNA má uniformní negativní náboj —> v elektrickém poli se pohybuje od katody k anodě • Části aparatury: elektroforetická vana, separační gel, pufr, zdroj stejnosměrného elektrického proudu • Velikost fragmentu DNA lze stanovit dle hmotnostních standardů (= reštrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, jejichž velikost byla stanovena sekvenováním) • EtBr - vmezeří se mezi báze, zviditelní DNA pod UV POWER SUPPLY CATHODE ELECTROPHORETIC BUFFER SAMPLE HIGH MOLECULAR WEIGHT SPECIES LOW MOLECULAR WEIGHT ANALYTES GeneRuler'" 100 bp ONA Ladder 0'GeneRuler'" 100 bp DNA Ladder, ready-to-use - 700 45.0 9.0 - 600 45.0 9.0 S00 115.0 23.0 - 400 40.0 8.0 - m 40.0 3.0 - 20P 40.0 8.0 Gelová elektroforéza - agarózová PCR - Polymerase Chain Reaction • Cíl - získání požadované a specifické sekvence genomové DNA bez jejího předchozího klonování • Princip - mnohonásobná replikace • 25 až 35 cyklů • závislost na teplotě reakční směsi • množství namnožené DNA roste exponenciální řadou (2n) • Termocycler PCR Protocol Get the reagents Prepare the mix Set up conditions Analyze the gel Negative result Cry saidoD ii m £ \|;i.'MU.HH\i\ ' pdL}j|duiu puc 'paicadaj si SS930Jd UOI)E31)l|dlUV |EjlU3Uodx3 S3ldo3 Ui il||m 1 = ift mm: nmn imm jmm 1TI1I1I min..... III!!!! lülülllll lllllllllll mrni l'l'l'l'l'l TTITITI ssidoa gl = niiiiiiiiiiiiiim iiiiiiiiiii ............... iiiimiii iiiiiiiiiiniiii ........... mmmimmm liiiüiiiiiiiiiiai S3ldCD 8 = (z lllllllllllllllllll iiiiliiiiiiiiiiim lilllll...........I — Spi3 puz soidoD f = i:ii:iiiiiiiiii;in t pucjis VNÜ 1U03SBU UIJOJ Ol j.-uuud ^vs i j i M, i i )i ! ] ! ! i i i i x tj^-U.u.x-ij.MJ i i i i i rmi «rr-T>Tr-TT7-.c > spucjis VNO uo!SU3)X3 c I I I I I I II I jJU I I I I I I I sjo uoiSa}] spuoj|S VNQ /ASU sozisoqiuXs 3SojsujA-|0,j (s OC 'D„f 6) spuDJis VNQ spuoip VNO O) puiq sjaiuijfj spuoj|s VNO »Itwbdas 0| o|dmos VNQ sjnjousQ Do ZL :VNQ eu>|e|A oi|aAOu ezajuÄs = 93eSuo|3 Do S9-0S :njauuud juezeAeu = §u||eauue Do 96 :(VNasp aoejedas) doem\eudp :n|>|ÄD jueAO>|edo 8DB>|!|d8J VNO Z JDjfaZBL|DÄA 8D>|B8J BA0Z8}8y 9DABUJn>|Z 3A 9DB>|!|d9J OJ}}A UI BUqOSBUOl]OU|AJ PCR DNA replikace - in vitro (PCR) • templátová DNA • dNTP • pufr(pH=8) TTľTľľTT Mg2+ ionty q DNA Polymerase t > Primers • Ovlivňují aktivitu a přesnost polymerázy primer • krátké specifické úseky DNA • oligonukleotid 20-25 pb • ohraničení oblasti amplifikace DNA DNA polymeráza • termostabilní (odolává teplotám až 98 °C) • Taq [Thermus oquoticus), Tth [Thermus thermophilus) teplota DNA replikace - in vivo • enzymy - helikáza, primáza, DNA polymeráza, ligáza ... DNA replication DNA polymerase uif.-M3:>ďh.x:ij:^:JMHMd>d4i ties qPCR • Intenzita fluorescence je přímo úměrná množství produktu, který v reakci vzniká • Detekce produktu: interkalační barviva -Sybr GREEN- nespecificky se váže na dsDNA SYBR Denature Polymerization Signal detection (Polymerization completed) S-^r-g- -^r TaqMan Annealing Primer ^ Probe ^ Polymerization & strand displacement ^ Q prim«r _.\ Probe J Cleavage Siqnal detection (Polymerization completed) sekvenčně specifická sonda - krátký oligonukleotid s barvičkou a zhášečem (TaqMan) - po jeho rozpadu při syntéze DNA nárůst fluorescenčního signálu (využívá 5'-3' exonukleázovou aktivitu DNA polymerázy) Video pro názornost: https://youtu.be/YhXi5Yy4ksQ Sekvenace DNA • Stanovení primární struktury DNA (pořadí nukleotidů) a) chemická metoda - dříve; degradace řetězců nukleových kyselin pomocí chemických činidel (dimethylsulfát, NaOH, hydrazin,..) - Maxam-Gilbertova metoda b) enzymatická metoda - specifická inhibice enzymové syntézy DNA (ddNTP) - Sangerova metoda c) moderní vel kof o r mátové aplikace založené např. na pyrosekvenování (sekvenování nové generace) • Produkt - řetězce ssDNA, jejichž vzájemná velikost se liší o jednu bázi (elfo rozdělení) • Vstupní materiál - fragment DNA s přesně definovanými konci Maxam-Gilbertovo sekvenování label Sekvence je odvozena z molekuly DNA, která se chemicky degraduje na fragmenty v místech, kde se vyskytuje báze určitého typu. Ty se následně separují pomocí elfo. Chemická činidla - příklad: - piperidin narušuje glykosidovou vazbu A a G (A + G) - hydrazin za přítomnosti NaCI reaguje pouze s C - NaOH při 90 °C způsobuje silné štěpení u A a slabé štěpení u C (A > C) Vyžaduje radioaktivní značení na jednom konci ssDNA. Reakce je prováděna ve 4 zkumavkách - v každé zkumavce jsou štěpeny pouze určité typy bazí. Vzniká směs různě dlouhých fragmentů končících v místě určité báze -> vyhodnocení pomocí elfo, stanovena sekvence daného úseku. i i i i i i i i i G>A A>G T+C G>A A>G T+C 1 I I 1 I I 1 I I ACAATGCGT Single stranded DNA template Cleave at specific bases Separate by gel electrophoresis antl detect labels T G C G T A A C A Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v= B5DJ8PL4E0 Sangerovo sekvenování • Enzymová metoda • Založeno na principu replikace - ukončení syntézy DNA v okamžiku, kdy se ddNTP zařadí na místo dNTP • ddNTP = analog dNTP, ale postrádá hydroxylovou skupinu na 3' pozici uhlíku • ddNTP - koncové terminátory • Reakční směs (4x) • DNAtemplát • primer • ddNTP-v nízké koncentraci • dNTP - v nadbytku (aby bylo možné získat fragmenty všech možných délek) • Taq DNA polymeráza - syntéze DNA od 5' ke 3' konci • pufr • Vyhodnocení - elektroforéza • Modifikace —> fluorescenčně značené ddNTP (4 různé barevné značky) - reakce provedena v jedné zkumavce G A T C TGG-CGACGA lili I IZl3l4l5l6|7;e9IIO Video pro názornost: https://www.voutube.com/watch?v=wdS3iOTgbiM Sangerovo sekvenování Kapilární sekvenace DNA s fluorescenčně značenými ddNTP ® Reaction mixture ► Primer and DNA template * DNA polymerase ► ddNTPs with flourochromes ► dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) Prim or 5' I I I I II I I I 3' Template ddNTPs V ddTTP -ddCTP- ddATP -ddGTP- ® Primer elongation and chain termination 5 I I I I 5-r- 5'i-r F1 ST 5't 5' -r 5'-r I T I I " i 3' T, 3' i i i i r * 3' TV 3' M I + 3 ^^^^^^^^^ o a c ho-f-o—ř—o—l»- OH OH ^Q^J N* poo Oh Oh Oh 3 Capillary gel electrophoresis separation ol DNA fragments ® Laser detection of flourochromes and computational sequence analysis Chromatograph NGS - Next Generation Sequencing Sekvenování tisíců až milionů sekvencí současně Templátová DNA je fragmentována na úseky několik set bp dlouhé Konce fragmentů jsou enzymaticky zatupeny a napojeny k oligont určité sekvence (= adaptéry) Jednotlivé fragmenty jsou odděleně amplifikovány PCR a v dalším kroku paralelně sekvenovány Fragmented input DNA End Repair dA Tailing Adaptor Ligation Size Selection Amplification Next Generation Sequencing Využití: - celogenomové sekvenování - sekvenování chromozomů, plazmidů, mt - studium genetické variability mutační analýza - transkriptomová analýza Video pro názornost: https://voutu.be/iFCD8Q6qSTM https://www.voutube.com/watch?v=-kTcFZxP6kM Praktická část cvičení PCR • 65 °C • 4 hodiny (nebo over night) ELFO 2. ELFO restrikčních fragmentů po štěpení Taql (nerozštěpený = polymorfismus) ELFO - praktické provedení 1. Připravit nalévací misku + hřebínky. 2. Připravit gel (2%): navážit agarózu a přenést do Erlenmayerovy baňky přidat lxTBE pufr (200 ml) 3. Zvážit a v mikrovlnce přivést k varu. 4. Po zchladnutí na cca 40 °C přidat EtBr (1 u.1 / 10 ml). 5. Nechat gel ztuhnout (cca 30 min). 6. Odstranit hřebínky a gel vložit do elektroforetické vany s lxTBE pufrem (elektrolyt). 7. Připravit kapky nanášecí barvy na parafínový papír a smíchat s vzorky DNA. 8. Vzorky nanést do jamek. 9. Zapojit do zdroje elektrického napětí. 10. Sledovat postup DNA gelem (20min). 11. Vizualizace pod UV a vyhodnocení. Práce s mikropipetou Mikropipeta 1 - dvoupolohový ovladač 2 - držák 3 - jednorázová špička • Pipetu držím vždy vertikálně (špičkou dolů). • Pipetu držím v dlani zavěšenou za ukazováček a ovládám ji palcem. • Vyberu optimální rozsah objemu!!! Nikdy neprekračujú rozsah pipety nahoru ani dolů!!! • Před pipetováním musíme na pipetu nasadit příslušnou špičku (dle objemového rozsahu pipety). • Vždy používám novou sterilní špičku. • Pokud opakovaně pipetuju tentýž roztok, ponechám na pipetě po celou dobu práce tutéž špičku. • K odhazování špiček slouží tlačítko na boční straně pipety. Video pro názornost: https://www.voutube.com/watch?v=aSeodlY5MRc Práce s mikropipetou Postup: • Na pipetě nastavím požadovaný objem. Vodorovná čára na displeji značí desetinnou čárku. • Nasadím špičku na pipetu (důkladně utěsním) - ne rukama! • Pipetu uchopím tak, abych si o ukazováček podepřel/a držák a palcem tak mohl/a pracovat s dvoupolohovým ovladačem. Obr. 3.2.2: Polohv ovladače: o • Nasátí: ovladač stlačím do polohy „1" (špička je ve vzduchu), ponořím do roztoku a pomalu pustím. • Vypuštění: pipetu ponořím do roztoku, kam chci pipetovanou látku přidat. Vypustím roztok stlačením ovladače do polohy „1", dokončím stlačením do polohy „2" a vyjmutím špičky z roztoku (stále v poloze „2"). • Ovladač pustím, špičku vyhodím. Další metody Western blot • Kvalitativní nebo semi-kvantitativní detekce proteinů • Princip - detekce proteinu v gelu v elektrickém poli s využitím vazby antigen-protilátka • 3 fáze 1. Elektroforetická separace proteinů (polyakrylamidový gel) 2. Přenos separovaných proteinů 3. Detekce proteinů Created in BiúRend*r.ťorrt bib Gelová elektroforéza - ostatní TH2B2 AR! THE KIHDS OF WEST2RHS._ POD VAH m G003 TH2 BAD AHD TH2 UGLY Děkujeme za pozornost