Genetika v ZL
Zánětlivé postižení parodontu
Monogenní onemocnění
̶ Jasná demonstrace genetické mutace v jednom lokusu podmiňuje
náchylnost k rozvoji periodontitidy.
Papillon LeFevre Syndrom (PLS)
Klinicky charakterizováno jako:
Palmoplantarní hyperkeratosa
Těžký časný nástup parodontitidy, která vede k
předčasné ztrátě primárního a sekundárního chrupu
(odlišuje PLS od jiných plamoplantarních
keratodermií)
Prevalence 1/4 miliony
Bez vztahu k pohlaví
CTSC gen kodující Katepsin C proteázu
CTSC gen leží na chromosomu 11q14-Q21; 7 exonů kóduje
lysozomální proteázu katepsin C
Je exprimována ve vysokých hladinách v různých imunitních
buňkách, včetně polymorfonukleárních leukocytů,
makrofágů a v epiteliálních oblastech běžně postižených
PLS, včetně dlaně, plosky, kolena, a ústní keratinizované
gingivy (RT-PCR) (Hart et al., 1999).
Kathepsin C je proteáza, která zpracovává a aktivuje řadu
granulárních serinových proteáz důležitých pro imunitní a
zánětlivé reakce myeloidních a lymfoidních leukocytů
Mutace v genu pro katepsinu C
(CTSC)
Exon 1 „nonsense“ mutace (856CT): předčasný stop kodon v pozici 286. aminokyseliny
Tři mutace v exonu 2:
delece jednoho nukleotidu (2692delA) v kodonu 349: frameshift a předčasný stop kodon,
2 bp delece (2673-2674delCT): stop kodon v pozici aminokyseliny 343,
substituce G/A v kodonu 429 (2931G/A): předčasným stop kodon.
Zkrácený nebo konformačně alterovaný proteinu nemusí být transportován
do organely a nemusí být schopen aktivovat protein kinázy
Jinými slovy, aktivita Katepsinu C u těchto pacientů téměř chybí
Multifaktoriální onemocnění
Onemocnění parodontu – lokální problém?
IL-1 Gene Polymorphisms
̶ 1997 Kornman et al – asociace polymorphismů v genu kódujícím
IL-1a(-889) a IL-1B(+3953) se závažnějšími formami
parodontitidy.
̶ IL-1 polymorfní klaster (PST-periodontitis susceptibility trait) byl
asociován se závažností PD pouze u nekuřáků, rozlišil jedince s
těžkou parodontitidou od mírného onemocnění.
Genetic control of IL-1: Genes and Locus of SNPs associated with controlling IL-1 biological activity
Genes Polymorphism
Locus
Current Locus
assessed with test
Controlled product
IL-1A Allele 2 -889 Allele 2 IL-1A +4845 IL-1 alpha
IL-1B Allele 2 +3953 Allele 2 IL-1B +3954 IL-1 beta
IL-1RN Protein receptor antagonist
(impedes IL-1 alpha and beta)
Genetic Susceptibility Test for periodontitis: tests for the
presence of at least one copy of allele 2 at the IL-1A +4845 loci
and at least one copy of allele 2 at the IL-1B +3954 locus.
*IL-1A +4845 is being used because it is easier to identify than IL-1A -889 and it is essentially concordant
with it.
** IL-1B +3953 has been now renumbered as IL-1B +3954 because the current convention indicates that the
numbering of the transcription should begin at +1 instead of zero.
Interleukin 1
̶ Prozánětlivý multifunkční cytokin.
̶ Umožňuje pronikání zánětlivých buněk do míst infekce
̶ Podporuje kostní resoroption
̶ Stimuluje uvolňování eikosanoidů (PGE2) monocyty a fibroblasty
̶ Stimuluje uvolňování MMP, která degraduje proteiny ECM.
̶ Formy IL-1α a IL-1B
IL-1 jako modulátor periodontitidy
+IL-1 genotyp a IL-1 protein
̶ Konkrétní parodontitidy-asociovaný IL-1 genotyp sestává z varianty v IL-B genu,
který je spojen s vysokými hladinami IL-1 (Poiciot et al 1992)
̶ Pacienti pozitivní pro sloučený IL-1A (4845) a IL-1B (3954) sparodontitidouasociovaný
genotyp mají vyšší hladiny IL-1B na GCF, ale ne v gingivální tkáni před a
po ošetření (Kornmann et al 1999)
̶ Nositelé alely 2 (-889) u pacientů s chronickou parodontitidou vykazovali téměř
čtyřnásobný nárůst hladiny IL-1 (Shirodaria et al., 2000)
TLR
̶ Poprvé popsány jako gen pro typ I transmembránového receptoru
 důležitá úloha při dorzoventrálním vývoji embrya Drosophily
 absence tolls vedla i k vážnému postižení obranyschopnosti proti
plísním a G+ bakteriím
Nalezeny savčí homologa – podobná úloha ???
TLRs receptory a jejich ligandy u
onemocnění parodontu
Periodontitis - akutní
Akutní periodontitis (apikální)
̶ Hyperémie a serozní exsudace
̶ Hnisání, osteoklastická přestavba kostní tkáně
̶ 4 fáze
Periodontální (desmodontální)
Endoseální
Perisotální
Submukosní
̶ Silná bolestivost ve všech fázích, otoky v pozdějších fázích
̶ vztah polymorfismů v genech pro IL1B, IL1RN, FcγRIIIb, VDR a TLR4 s agresivním
typem parodontitidy.
Periodontitis - chronická
 Sekundárně z akutní periodontitis
 Primárně chronická (častější)
Formy
 Cirkumskriptní (granulomatozní)
 Granulomatozně progresivní – píštěle (slizniční, kožní)
 Difúzní – odbourávána i alveolární kost
 Granulační tkán
 Makrofágy
 Možnost tvorby radikulární cysty
S chronickým typem parodontitidy jsou spojovány polymorfismy v genech pro IL1B, IL1RN, IL6, IL10,
VDR, CD14, TLR4 a MMP1.
Meta-analýza publikovaných dat asociovala varianty polymorfismů IL1A-889, IL1B 3954, IL1B-511,
TNFA-308 a IL6-174 k agresivní i chronické parodontitidě.
Farmakogenetika
22
Cíl
Na základě interdisciplinárního integrace
znalostí farmakologie a genetiky popsat
vliv dědičnosti na odpověď organismu na
různé léky.
Farmakogenomika
Farmakodynamika: popisuje žádoucí či
nežádoucí účinky léků na organismus
(lék organismus)
Farmakokinetika: se zabývá hladinami léků a
jeho metabolitů v různých tkáních a vstřebáváním
léků, jejich distribucí, metabolismem a eliminací
(organismus  lék)
24
Vztah ke genům
Téměř každá dráha metabolismu léku, jeho transportu nebo
aktivace je ovlivněna genetickou variabilitou.
Klinická variabilita v odpovědi
Riziko vedlejších účinků
Genotypově specifické dávkování
Polymorfní cíle léku
Výhody „Genomické medicíny“ – klinický
potenciál
Odhalení onemocnění v
raném stádiu, kdy je
snadnější účinně léčit;
Usnadnění výběru optimální
léčby a omezit léčbu pokus-
chyba;
Snížení výskytu
nežádoucích účinků;
Zvýšení odpovídavosti
pacienta na léčbou;
Zlepšení výběru cílů ve
vývoji léků a snížit čas,
náklady a selhání
klinických zkoušek;
Důraz na prevenci;
Snížení celkových
nákladů na zdravotní péči.
26
Farmakogenetika a vývoj léků
Nutnost přesné diagnózy (k fenotypicky
podobným stavům mohou vést různé
patobiochemické mechanismy).
Individuální odpověď jedince na terapii může
záležet na genech, vstupujících do interakce s
metabolismem léku nebo jeho působením.
27
Klinicky relevantní genetické polymorfismy ve vztahu k vedlejším účinkům léků
28
Klinicky relevantní genetické polymorfismy
ve vztahu k účinnosti léků
29
P450
CYP3A4 – 50% metabolizovaných léků
CYP2D6 – 20%
CYP2C9 + CYP2C19- 15 %
CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 a CYP2A6 byly
prokázány jako funkčně polymorfní
Např. ovlivňuje metabolismus warfarinu, acenocoumarolu a
dalších léků (phenotyoin, tolbutamid, glipizide a další perorální
antidiabetika typu sulfonylurey).
30
Cytochrom P4502C9 (CYP2C9)
dvě alelické varianty genu CYP2C9 1, 2
CYP2C9*2
záměna C430T v exonu 3 vede k substituci Arg144Cys
CYP2C9*3
záměna A1075C v exonu 7 vede k substituci Ile359Leu
in vitro má CYP2C9*1 normální, zatímco varianta CYP2C9*2 vykazuje menší
a CYP2C9*3 podstatně menší enzymatickou aktivitu 3, 4
fenotypickým projevem je snížení clearance léků závislých na CYP2C9
1. Stubbins MJ et al: Pharmacogenetics 1996; 6:429-329 3. Rettie AE et al: Pharmacogenetics 1994; 4:39-42
2. Veronese ME et al: Biochem J 1993; 289:533-8 4. Haining RL et al: Arch Biochem Biophys 1996; 333:447-58
31
Dávka / antikoagulační efekt warfarinu
12. Alving BM et al: Arch Intern Med 1985; 145:499-501
13. Oldenburg J et al: Br J Hematology 1997; 98:240-4
polymorfismus
cytochromu P450
CYP2C9*2
CYP2C9*3
rezistence na
warfarin
- jaterní receptor
pro warfarin
mutace FIX
genetické faktory vlivy prostředí
vztah dávka / odpověď
na warfarin
12
13
32
33
CYP2C9 ACTIVITA
Prescribed Daily Warfarin Dose and CYP2C9 Genotype
Warfarin Dose* Genotype
5.63 (2.56) *1/*1
4.88 (2.57) *1/*2
3.32 (0.94) *1/*3
4.07 (1.48) *2/*2
2.34 (0.35) *2/*3
1.60 (0.81) *3/*3
*Data presented as mean (SD) daily dose in mg
From: Higashi MK, et al. Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related
outcomes during warfarin therapy. JAMA 287:1690-1698, 2002.
Klinické projevy polymorfismu
CYP2C9
předávkování při zahájení antikoagulace standardními režimy 14, 16, 17, 18, 19
nižší udržovací dávka nutná k dosažení a udržení terapeutického rozmezí 11,
15, 16, 18, 19
vyšší riziko předávkování dané interakcemi s léky metabolizovanými a/nebo
reagujícími s CYP2C9 17, 21
nestabilita antikoagulační terapie 15, 16
delší přetrvávání antikoagulačního efektu po přerušení léčby nebo snížení
dávky warfarinu
14. Aithal GP et al: Lancet 1999; 353:717-9 16. Higashi HK et al: JAMA 2002; 287:1690-8
15. Taube J et al: Blood 2000; 96:1816-9 17. Verstuyft C et al: Eur J Clin Pharmacol 2003; 58:739-45
34
Interakce s léky metabolizovanými a/nebo
reagujícími s CYP2C9
Soutěž o substrát Enzymový induktor Enzymový inhibitor
ASA a většina NSAID rifampicin fluvoxamin (ostatní SSRI slabí)
fenobarbital, fenytoin fenobarbital, fenytoin omeprazol
S-warfarin karbamazepin inhibitory HMG-CoA reduktázy
losartan tolbutamid
tolbutamid cimetidin (slabý)
sulfonamidy, dapson azolová antimykotika (slabá)
diazepam, tenazepam ritonavir
fluoxetin, moclobemid desethylamiodaron
zidovudin
17, 20, 21
20. Topinková E et al: Postgrad Med 2002; 5:477-82
21. Naganuma M et al: J Cardiovasc Pharmacol Ther 2001; 6:636-7
35
Rychlost metabolismu
Dle aktivity enzymu může být populace rozdělena do čtyř
hlavních skupin - pomalí metabolizátoři (PM),
intermedierní metabolizátoři (IM), efektivní metabolizátoři
(EM) a ultrarychlí metabolizátoři (UM).
Většina jedinců bílé populace patří mezi tzv.extenzivní
metabolizátory (EM), u nichž jsou léčiva
metabolizovány předpokládanou rychlostí.
5-10 % jedinců je geneticky determinováno jako pomalí
metabolizátoři (PM), kteří mají zpomalené odbourávání
látek metabolizovaných a jsou ohroženi vyšším výskytem
nežádoucích účinků léčby.
Intermedientní metabolizátoři (IM) jsou zastoupeni v 10-
15 % a při dlouhodobé léčbě jsou svými reakcemi na
léčbu srovnatelní se skupinou PM.
U ultrarychlých metabolizátorů (UM) probíhá
metabolizace intenzivněji a klinicky nereagují na běžné
dávky léků a je zastoupena v 5-10 %.
Medical Hypotheses, Volume 144, November 2020, 110033
Marker CYP1A2 CYP2B6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 Model Ref.
IL-1β ND ND ND ND ND ↓↓↓ Human
hepatoma
cells
[87]
IL-6 ND ND ND ND ND ↓↓↓
TNFα ND ND ND ND ND ↓↓↓
IL-1β ND ND ND ND ND ↓↓↓ Human
hepatocytes
[45]
IL-1β ↔ ↔ ↔ ND ND ↔ Human
hepatocytes
[113]
IL-6 ↔ ↓↓↓ ↓ ND ND ↓↓↓
IL-6 ↓↓ ↓↓↓ ND ND ND ↓↓↓ HepaRG cells [114]
IL-1 ↓↓↓ ND ND ND ND ↓↓↓ Human
hepatocytes
[115]
IL-6 ↓ ND ND ND ND ↓↓
TNFα ↓↓ ND ND ND ND ↓↓
IL-1 ND ↔ ↔ ↔ ND ↓↓↓ Human
hepatocytes
[42]
IL-6 ND ↓↓↓ ↓↓ ↓↓ ND ↓↓↓
TNFα ND ↔ ↔ ↔ ND ND
IL-2 ND ↓↓ ND ND ND ↓↓ Peripheral
blood
mononuclear
cells
[116]
IL-6 ND ↓ ND ND ND ↓
IL-10 ND ↔ ND ND ND ↔
IL-6 ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓ ND ↓↓↓ Cryopreserve
d human
hepatocytes
[40]
↓ indicates up to 25% decrease, ↓↓ indicates 26–50% decrease, ↓↓↓ indicates > 50% decrease, ↔ indicates no
change, CYP cytochrome P450, IL interleukin, ND not determined
Medical Hypotheses, Volume 144, November 2020, 110033
Difference in drug metabolism and pharmacological outcomes between healthy and inflamed
liver in COVID-19 patients. Lopinavir, an anti-retroviral drug that has been repurposed for
COVID-19, has been taken as an example, but this prototype flowchart is applicable to all
drugs that are metabolized to inactive metabolites by cytochrome P450 enzymes, especially,
through the CYP3A4 isoform
Medical Hypotheses, Volume 144, November 2020, 110033
RAS
Geny v červeném oválu leží na X chromosomu (muži mají jen jednu alelu);
významný rozdíl ve fyziologii mezi muži a ženami
The vasoconstrictor/proliferative and the vasodilator/antiproliferative actions of the RAS mediated by Ang II and Ang(1–7),
respectively, depend on the ACE/ACE2 ratio balance
Abbreviations: ACE, angiotensin-converting enzyme; and Ang, angiotensinogen .
41
BRO
NJ
Age
Obesity Smoking
Cancer diagnosis
Genetic background
Osteonecrosis of the jaw induced
by bisphosphonates (BP)
BRONJ free
BP users
BRONJ
BP users
Genome-wide
Sreening
DNADNA
SNPs in RBSM3 RBSM3
COL1
Prx1
Fibroblast
+
RBSM3 ; Col1
Expression
Osteoporosis
RBSM3
42
Metotrexát u RA
Efektivita léčby revmatoidní artritidy (RA) metotrexátem
(MTX) 46% - 65 % (ACR 20)
Při léčbě MTX se mohou vyskytnout nežádoucí účinky.
Alespoň jeden u 72,9% pacientů, závažné až u 30%
pacientů.
gastrointestinální toxicita (nevolnost, zvracení, průjem, 20% - 65%
hepatotoxicita 10% - 43%
orální ulcerace 37%
alopecie až 4%
pulmonální toxicita 2,1% - 8%
útlum kostní dřeně lehký 12%
pancytopenie 0.8%
43
Foláty
Gastrointestinální
toxicita
Dihydrofoláty
Adenosin -
uvolňování
5,10-methylen tetradydrofolát
5,10- methenyl tetrahydrofolát
10- formyl tetrahydrofolát
5-methyl tetradydrofolát
Syntéza polyaminů
44
Účinek MTX v buňce – cíle pro SNPs
MTXPG přímo inhibuje enzymy důležité pro syntézu purinů a pyrimidinů –
thymidylát syntázu (TYMS) a dihydrofolát reduktázu (DHFR). DHFR se
účastní na konverzi homocysteinu na methionin a tím pro syntézu
polyaminů.
Metabolismus adenosinu
Ovlivnění metabolismu adenosinu patří k nejdůležitějším mechanismům
protizánětlivého působení metotrexátu.
MTXPG inhubuje 5-aminoimidazol-4-karboxamid ribonukleotid
formyltransferáza (ATIC), tím zprostředkovává vliv na metabolismus
adenosinu (imunosupresivní účinek).
45
Nitrobuněčný metabolizmus MTX – cíle
pro SNPs
Vstup do buněk pro foláty a antifoláty
přenašeč SLC19A1 nebo reduced folate carrier (RCF-1)
folátové receptory (FR-α a FR-β), endocytóza - nižší afinita MTX k
receptorům než foláty (malý význam metabolické cesty)
Transport MTX z buňky - efluxní transportéry z rodiny ABC (ATPbinding
cassette) např. (ABCC1-4 a ABCG2).
Intracelulární metabolizmus – přidání 2 až 5 glutamátových skupin →
aktivní metabolit, polyglutamát metotrexátu (MTXPG), v buňce se
hromadí. Tento proces je katalyzován folylpolyglutamát syntetázou
(FPGS) a je reverzibilní prostřednictvím gamaglutamyl hydrolázy
(GGH)
46
Methotrexát
Ranganathan P, McLeod HL. A&R 200647
Methotrexát
Ranganathan P, McLeod HL. A&R 200648
MDR1
MDR1 (ATP-binding cassette B1/multidrug resistance 1) is an efflux pump that
transports toxic endogenous substances, drugs and xenobiotics out of cells.
It is known to affect susceptibility to many hematopoietic malignancies.
ABCB1/MDR1 polymorphisms may either change the protein expression or
alter its function, suggesting a possible association between ABCB1/MDR1
single nucleotide polymorphisms (SNP) and clinical aspects of T-cell
lymphoma.
Therefore, association of two polymorphisms in the gene with clinical staging
and therapy was evaluated.
49
50
(A) An example of an experimentally verified miRNA pharmacogenomic set. miR-125 b
inhibits vitamin D receptor (VDR) expression.
Rukov J L et al. Brief Bioinform 2013;bib.bbs082
© The Author 2013. Published by Oxford University Press.
MicroRNA (miRNA) – regulace genů důležitých pro funkci léků.
Interakce miR-gen–lék prostřednictvím degradace farmakologicky
relevantního cíle.
52
From: Esteller M, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to
alkylating agents. NEJM 243:1350-1354, 2000.
Epigenetika
MGMT – methylguanine-DNA
methyltransferase
Metylatilace promotoru MGMT
silencing genu
53
From: Esteller M, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to
alkylating agents. NEJM 243:1350-1354, 2000.
Perzonalizovaná medicína
54
55
Genová terapie: typy nemocí
Infekční nemoci
Rakoviny
Vrozené nemoci
Nemoci imunitního systému
56
Genová terapie
Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci
genetickou modifikací buněk pacienta.
Do buněk se transferují: geny, jejich části nebo oligonukleotidy.
Genová terapie in vivo: transfer přímo do buněk pacienta
Genová terapie in vitro: genové modifikace probíhají mimo
organismus
Genová terapie ex vivo: modifikované buňky se vracejí do
organismu
Naked DNA
Target
Cell
Therapeuti
c Protein
AAV
Retrovirus/Lentivirus
Adenovirus
Nucleus
Principy genové terapie
Tissue Engineering v praxi: – temporomandibulární kloub.
(a) design teoretického, místně specifického implantátu temporomandibulárního kloubu
pomocí pevné výroby bez formy
(b) Kompozitní konstrukce z PLLA s diferencovanými prasečími chondrocyty a hydroxyapatitem (HA).
(c) Implantát za 4 týdny po implantaci.
Review Article
Tissue engineering: state of the art in oral rehabilitation
E. L. SCHELLER*, P. H. KREBSBACH* & D. H. KOHN*,† *Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, J
Oral Rehabil. 2009 Feb 17. [Epub ahead of print –doporučuji přečíst! ! !
Metody doručení genu do tkáně
vektor kapa-
cita
snadnost
produkce
integrace
do
genomu
trvání
exprese
transdukce
nedělících se
buněk
existující
imunita
bezpečnost přeno
s do
poto
mstva
nevirální bez
limitu
+++ zřídka dočasná ++ ne +++ ne
onko-
retroviry
8 kb ++ ano stabilní - ne inserční
mutagenese
aktivace
onkogenů
může
lentiviry 8 kb + ano stabilní ++ ne inserční
mutagenese
aktivace
onkogenů
může
adenoviry 30 kb + ne dočasná +++ ano hyperimunitní
odpověď
ne
adeno
asociated
virus AAV
4.6 kb + možná dlouho-
trvající
++ slabá +++ může
Herpes
viry
150 kb + ne dočasná ++ ano hyperimunitní
odpověď
ne
Nemoci v současnosti léčené genovou
terapií - př. ve fázi klinického testovánínemoc defekt cílové buňky četnost
těžká imunodeficience adenin deaminasa buňky kostní dřeně 1/1.000.000
(SCID) T-lymfocyty
hemofilie krevní faktor VIII a IX játra, svaly 1/1.000.000
muži
Cystická fibrosa CF plicní alveoly 1/2.500
Deficience emfyzém plicní alveoly 1/3.500
alfa-1-antitrypsinu
rakovina nespecifické 1/4
Neurodegenerativní nemoci degradace neuronů neurony v mozku 1/250
Parkinson, Alzheimer
infekční nemoci T-lymfocyty, makrofágy
AIDS, hepatitis B
Cystická fibróza
• mutace v iontovém přenašeči CFTR transmembrane
conductance regulator
• nejvíce postihuje plicní alveoly, střevní epitel a pankreas –
zvýšena produkce hlenu, citlivost k plicním infekcím.
• výhodou pro terapii je že stačí pouze několik molekul
proteinu na buňku aby se jí vrátila normální funkčnost.
• úspěšné pokusy v kulturách a na myších
transformovaných pomocí liposomů
• u lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru
nesoucího transgen CFTR do nosu, účinné v plicích,
nepůsobí na slinivku
principy genové terapie rakoviny
doručení konstruktu zajišťující zastavení
exprese onkogenu (antisense konstrukt)doručení nemutovaného supresorového
genu p53
využití onkoretrovirálních vektorů
principy genové terapie rakoviny
doručení sebevražedného genu přeměňující pro-drug na toxin
Nanotechnology Based Drug
Delivery Systems for Cancer
Therapy
Schematics - Reproduced from Sahoo and Labhasetwar, 2003 with kind permission from Drug Discovery Today.
http://www.cancer-therapy.org/CT3A/HTML/13.%20Orive%20et%20al,%20131-138%20.html 2005
Děkuji vám za pozornost 
68