Imunoanalýza
ELISA
MGR. JULIE ŠTÍCHOVÁ
FAKULTNÍ NEMOCNICE U SV. ANNY V BRNĚ
ÚSTAV KLINICKÉ IMUNOLOGIE A ALERGOLOGIE
Imunoanalytické metody
Rozdělení metod dle typu značky:
oEIA – značkou je enzym
oRIA - radioizotop
oLIA - luminofor
oFIA - fluorofor
Rozdělení metod dle uspořádání:
oHomogenní – bez promývání
oHeterogenní – s promýváním
oKompetitivní
oNekompetitivní
Vizualizace reakce antigen-protilátka pomocí značky
Imunoanalytické metody
Heterogenní kompetitivní:
o Analyt ze vzorku + značený analyt od výrobce – soutěž o omezené množství antigenu
o Měřený signál je nepřímo úměrný množství analytu
Heterogenní nekompetitivní:
o Detekční protilátka / antigen v nadbytku –analyt ze vzorku vyvázán
o Měřený signál je přímo úměrný množství analytu
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
oHeterogenní imunoanalýza – nutná separace nezreagovaných složek pomocí promývání
o Zahrnuje jednotlivé kroky
o Vazba antigenu / protilátky na pevnou fázi (stěna destičky)
o Na navázaný Ag se váže zkoumaná protilátka z přidaného séra
o Na navázaný komplex se váže sekundární protilátka s konjugovaným enzymem
o Pro vizualizaci se do reakce přidá substrát pro daný enzym - enzymatická přeměna substrátu na barevný
produkt – měření na spektrofotometru
o Používané enzymy:
o Křenová peroxidáza (tetrametylbenzidin  tetrametylbenzimidin  450 nm)
o Alkalická fosfatáza (p-nitrofenylfosfát  nitrofenol  405 nm)
o Mezi výše uvedenými jednotlivými kroky je vždy tzv. promývání, při kterém se nadbytek reaktantu odstraní
přídavkem pufru do jamky, který je pak také z jamky odstraněn – separace nezreagovaných složek
oVysoká citlivost – pg/ml
Kautování ELISA desky
oImobilizace Ag nebo Ab na plastový povrch desky
1. Povrchová aktivace desky
◦ vazba NH2 nebo COOH skupin – tvorba kovalentních vazeb s protilátkou nebo antigenem
◦ Vhodné pro stanovení malých molekul – např. peptidy
2. Pasivní adsorpce
◦ Hydrofobní interakce mezi nepolárními strukturami proteinu a plastovým povrchem desky
◦ Protein určený k adsorpci je rozpuštěn v alkalickém kautovacím pufru (pH 9,5) – naleptává plastový povrch a usnadňuje
adsorpci Ag nebo Ab
o Blokování desky
o Po navázání Ab/Ag zůstává část plastového povrchu
volná. Aby bylo zabráněno nespecifickým vazbám, je
nutno tato místa zablokovat inertní bílkovinou BSA
– bovinní sérový albumin
Vlastní průběh ELISY
Za každým krokem následuje tzv. promývací krok, kde se obsah jamky odsaje, do jamky se přidá nejčastěji
fosfátový pufr a následně se obsah jamky odsaje. Toto promytí se opakuje zpravidla 3x za sebou, aby byl
odstraněn veškerý nezreagovaný materiál.
Systém záchytná + detekční Ab
oDetekční (sekundární) protilátka proti hledanému Ag je konjugovaná s enzymem,
oProč je každá protilátka od jiného živočišného druhu?
Záchytná protilátka
myší, polyklonální
Detekční protilátka
humánní, monoklonální
Lidská monoklonální protilátka – s vysokou
specifitou váže pouze konkrétní antigen
Záchytná protilátka – s vysokou senzitivitou váže
všechny varianty daného antigenu
Tato kombinace významně snižuje riziko zkřížené reaktivity,
která by mohla způsobit vznik nespecifických imunokomplexů
(zdroj falešné pozitivity)!!!
Vyšetřovaný
Ag v séru
Enzymatická detekce – přidání substrátu
Nejčastěji používané enzymy detekčních nebo-li sekundárních protilátek:
◦ Křenová peroxidáza
◦ Alkalická fosfatáza
Pro křenovou peroxidázu jsou používány tyto substráty:
• 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin – po přídavku stop činidla (ředěná kyselina sírová) dojde ke změně barvy z
modré na žlutou  odečítání absorbance při 450 nm
• 2, 2´-azinobis(3-ethylbenzthiazol-6sulfonát)
• o-fenylendiamin
• o-dianisidin
• o-toulidin
Pro alkalickou fosfatázu se používá substrát
• 4-nitrofenylfosfát
Luminscenční Immunoassay
• Chemiluminscenční substráty – detekce záblesků luminiscence
• SuperSignal
• ECL
Sendvičová ELISA - uspořádání
oPoužití dvou protilátek specifických na různé
epitopy jednoho antigenu.
oJedna z protilátek je navázána na povrch
jamky destičky a vychytává antigen ze vzorku.
oDruhá protilátka značená enzymem slouží
k detekci tohoto antigenu.
oAntigen je tedy mezi protilátkami jako plátek
masa mezi houskami v sendviči.
oDetekce analytů s vysokou Mr (proteiny)
oVysoká přesnost
http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html
Sendvičová ELISA –vyšší senzitivita
oSystém biotin – avidin/streptavidin – na jeden imunokomplex se váže více molekul enzymu
oPo přídavku substrátu vzniká silnější zbarvení (pro analyty s nízkou koncentrací)
Kompetitivní ELISA - uspořádání
oDetekce analytů s malou Mr
http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html
o Na rozdíl od nekompetitivní ELISY se
navíc přidává enzymem značený Ag.
o Přidaný enzymem značený antigen
kompetuje – soutěží - s hledaným Ag v
séru o vazebné místo zkoumaného Ag.
o Čím více je zkoumaného Ag v séru, tím
méně se naváže enzymem značeného
Ag a tím nižší je pak měřená absorbce.
Komerční ELISA kity
Destička – odnímatelné stripy s jamkami –
lze upravit počet stripů v ELISE dle počtu
vyšetřovaných sér
Součástí kitu jsou:
Diluent
Promývací roztok
Konjugát
Substrát
Stop činidlo
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Sada již naředěných
kalibrátorů
Měření výsledků
oPřístroj ELISA reader
oPrincip – vertikální spektrofotometrie
o Zdroj světla – Xe výbojka
o Výběr vlnové délky – interferenční filtry
o Optická dráha – 9 optických vláken
(8 měří vzorky, 9. vlákno kontrola intenzity
záření)
o 9 detektorů - fotodiody
Podrobnější popis – skripta instrumentální techniky. Doc. Dastych a kol.
Výsledky
1. Kvalitativní
◦ Hodnotíme vizuálně přítomnost / nepřítomnost reakce  ano / ne
– výsledek je pak pozitivní či negativní, použití cut-off kalibrátoru, hodnoty s absorbancí nad tuto
hodnotu jsou hodnoceny jako pozitivní
2. Semi-kvantitativní
◦ IP (index pozitivity) = absorbance vzorku / absorbance cut-off kalibrátoru
3. Kvantitativní
◦ Kalibrační křivka – ředění kalibrátoru o známé koncentraci analytu
◦ Výsledek (absorbance = OD, optická denzita) se odečítá z kalibrační křivky
◦ Přepočet absorbance na koncentraci (Lambert-Beerův zákon)
◦ Výsledek má číselnou hodnotu s udanými jednotkami (např. U/ml, ug/ml)
Hodnocení výsledků - kvantitativní
Kalibrační řada
Blank
Negativní kontrola Pozitivní kontrola
Vzorky pacientů
Příklad
ELISA ACLA - kvantitativně
◦ Výsledky ELISY z readru
◦ Metoda ACLA - protilátky proti kardiolipidům při
vyšetření antifosfolipidového syndromu
◦ Výtisk obsahuje:
◦ hodnoty absorbance
◦ musí být uvedeno datum provedení testu
◦ musí být uvedeno, kdo test hodnotil – jméno VŠ
◦ musí být uveden název testu
◦ musí být uvedeno, kdo daný test zpracovával =
jméno laborantky
◦ Kalibrační křivka
◦ Dále hodnoty absorbance pro jednotlivé vzorky a
přepočet na koncentraci dle kalibrační křivky,
uvedené jednotky (např. IU/ml) (není vyobrazeno)
Kalibrace
Pozitivní k.
Negativní k. Výsledky pacientských vzorků
Využití ELISA v imunologii
oAntiinfekční imunita
o Stanovení protilátek proti některým infekčním agens
oAutoimunitní onemocnění
o Stanovení autoprotilátek
ELISA a antiinfekční imunita
oStanovení přítomnosti protilátek proti vybraným infekčním agens
o Protilátky proti tetanickému toxoidu
o Protilátky proti difterickému anatoxinu
o Protilátky proti kapsul. antigenu Haemophilus influenzae typ b
o Protilátky proti specifickému pneumokokovému kapsulárnímu polysacharidu (anti-PCP)
Jak reaguje imunitní systém pacienta?
Sledování imunitní odpovědi na vakcinaci  zájem
především o snížené hladiny  podezření na
imunodeficience!
Mikrobiologie Imunologie
Čím se pacient nakazil?
Diagnostika probíhající / prodělané infekce
Očkování
ELISA a autoimunitní onemocnění
oPoužívá se téměř výhradně sendvičové uspořádání
oHledáme autoprotilátky – destička potažena antigenem
ELISA a autoimunitní onemocnění
oStanovení celé škály autoprotilátek (orgánově nespecifické, orgánově specifické)
o ANA – proti jaderným antigenům (anti-nuclear antibody; Systémový lupus erythematodus -SLE)
o ENA – proti extrahovatelným nukleárním antigenům (SS-A, SS-B Sjogrenův sy. a další)
o AMA – proti mitochondriím (primární biliární cirhóza)
o ASMA, LKM, LC - autoimunitní hepatitidy
o ASMA - proti hladkým svalům (anti – smooth muscle antibodies)
o LKM - proti mikrosomům jater a ledvin (LKM – liver kidney microsomes autoantibodies)
o LC - proti antigenu jaterního cytosolu typu 1
o ANCA – proti cytoplazmě neutrofilů (autoimunitní vaskulitidy a glomerulonefritidy)
o cANCA – antigen je myeloperoxidáza
o pANCA - antigen je proteináza 3
o Anti-TTG –proti tkáňové transglutamináza (celiakie)
o Anti-TG-tyreoglobulin, anti-TPO-tyreoidální peroxidáza (autoimunitní onemocnění štítné žlázy)
o RF – proti Fc molekule IgG (revmatoidní artritida)
o EMA –proti endomysiu (celiakie)
o ASCA (pozor – není to autoprotilátka!) proti Sacharomyces cerevisiae (Crohnova choroba)
Další metody vyšetření autoprotilátek – přehled
platí pro pracoviště ÚKIA FNUSA
1. Imunofluorescence – samostatná přednáška
2. Přístrojová ELISA – analyzátor Alegria
3. Chemiluminiscence – analyzátor Isys
4. Enzymově zesílená chemiluminiscence – analyzátor Immulite - samostatná přednáška
5. Imunoblot – samostatná přednáška
Analyzátor Alegria
Princip – ELISA na stripech – stanovení autoprotilátek
Jamka 1 a 2: prázdné, určené k ředění vzorku
Jamka 3 a 4: pokryté antigenem
Jamka 5: pozitivní kontrola (obsahuje hledanou autoprotilátku)
Jamka 6: křenovou peroxidázou označená anti-lidská IgM/G/A
Jamka 7: ředící pufr
Jamka 8: TMB substrát (tetra-methyl-benzidin)
• Stačí pouze odtrhnout
alobal z prvních 4 jamek
a do první z nich
napipetovat pacientovo
sérum (10ul) 
analyzátor provede
ELISU sám
• Nevýhoda – v porovnání
s ruční ELISOU drahé
Čárový kód – identifikace stripu
Analyzátor Isys
oPrincip – chemiluminiscence
oPevná fáze – magnetické kuličky
oMěření světelné emise která vzniká
chemickou reakcí
oExtrémní citlivost
oSignál úměrný koncentraci auto-Ab ve
vzorku
oV naší laboratoři:
o Stanovení ENA (screening + jednotlivé antigeny)
o TTG (tkáňová transglutamináza – celiakie) – třídy IgA a IgG
o dsDNA – třída IgG (systémový lupus - SLE)
o ACLA – kardiolipin (antifosfolipidový syndrom) – třídy IgM a IgG
Magnetická kulička s
navázaným antigenem
– separace magnetem
při promývání
Antigen
Pacientova autoprotilátka
Sekundární protilátka proti
lidskému IgG/A/M značená
akridinium esterem
akridinium ester
3. Při návratu elektronů do
základní hladiny - světelná
emise  záznam
luminometrem
1. Přídavek:
Trigger 1: alkalický pufr
Trigger 2: H2O2
2. Vlivem oxidace dochází k
excitaci akridinium esteru
Protokoly
•Hlavička
•Princip metody
•Pomůcky
•Postup
•Výsledky – sestrojit kalibrační křivku, odečíst hodnoty pacientů
- popsat jakou autoprotilátku stanovujeme, pro jaké onemocnění je typická
•Zhodnotit, co výsledek ELISY pro pacienta znamená