Prietoková cytometria a stanovenie lymfocytárnych subpopulácií Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz) Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU Cluster Designation (Cluster of Differentiation) • Bunky exprimujú (vystavujú) na svojom povrchu rôzne špecifické molekuly – znaky, ktoré môžeme usporiadať do skupín charakterizujúcich bunečnú líniu, stav diferenciácie jednotlivej bunky a jej aktiváciu • CD klasifikácia: pokiaľ je molekula (znak, marker) na povrchu bunky známej štruktúry a je rozpoznateľná monoklonálnou protilátkou je zaradená do skupiny diferenciálnych CD znakov a označená číslom (CD1, CD2, CD3,...). V súčasnej dobe je na ľudských leukocytoch charakterizovaných asi 400 znakov. • Využitie: - označenie plne definovaných molekúl na povrchu buniek - rozdelenie podľa funkcie: adhézne membránové molekuly, receptory pre cytokíny, molekuly na T a B lymfocytoch, trombocytoch a ďalších bunečných populáciách - Imunofenotypizácia buniek pomocou prietokovej cytometrie Blausen.com staff (2014). "Medical gallery of Blausen Medical 2014". WikiJournal of Medicine 1 (2). DOI:10.15347/wjm/2014.010. ISSN 2002-4436. Leukocyty: počet leukocytov v krvi – 4-10x109/l Granulocyty T-lymfocyty (Th CD4+; Tc CD8+) B-Lymfocyty NK bunky Všechny leukocyty: CD45 Panleukocytární znak Neutrofily: CD15 Monocyty: CD14 Imunofenotypizácia buniek • stanovenie leukocytárnych subpopulácií pomocou prietokovej cytometrie (FACS- fluorescent-activated cell sorting) • odber krvi do skúmavky s EDTA T lymfocyty CD3 - povrchová molekula prítomná na všetkých T-lymfocytoch Fyziologické zastúpenie v periférnej krvi: 58-85 % z Lymfocytov http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/GeneralBiology/Immunology/Recognition/Tc ell/Tcellcomplex/Tcellcomplex.htm CD4+ TH (TH1, TH2) pomocné T-lymfocyty (T helper cells) T- lymfocyty sa delia na: CD8+ TC cytotoxické T-lymfocyty (cytotoxic T-cells) Fyziologické zastúpenie z celkových CD3+ T-lymfocytov 30-60 % 15-35 % Stavba T- bunečného receptoru TCR a umiestnenie koreceptorových molekúl CD3, CD4, CD8 zapojených do signalizácie cez T-bunečný receptor TCR CD19 B lymfocyty CD19, CD20 - povrchové molekuly najčastejšie využívané k rozlíšeniu B lymfocytov v prietokovej cytometrii Vhodne zvolená kombinácia iných CD znakov slúži k presnejšej charakterizácii jednotlivých vývojových štádií a funkčných subpopulácií Fyziologické zastúpenie v periférnej krvi: 7-23 % z Lymfocytov CD19 súčasťou B-bunečného receptoru BCR NK (Natural Killer) bunky CD16+CD56+CD3- - charakteristické povrchové markery Fyziologické zastúpenie v periférnej krvi: 6-20 % z Lymfocytov - rozpoznávajú bunky, ktoré majú na povrchu abnormálne málo MHC I (= nádorové a vírom infikované bunky) - Na zničenie bunky používajú cytotoxické mechanizmy (perforin, granzymy) Pozor!!! Okrem klasických NK ešte existujú NKT bunky: CD16+CD56+ CD3+ Monocyty CD14 - povrchová molekula charakteristická pre monocyty Fyziologické zastúpenie v periférnej krvi: 0-10 % z Leukocytov - súčasť nešpecifickej imunity - schopnosť fagocytózy - tkanivová forma = makrofág - APC = antigén prezentujúca bunka Na svojom povrchu exprimujú HLA DR – Human Leukocyte Antigen DR isotype - naviazanie peptidov z pohltených patogénov → → rozoznanie pomocnými T-lymfocytmi - cytometrický marker pre imunitnú odpoveď CD14 ako koreceptor TLR4 zapojený do detekcie bakteriálnych lipopolysacharidov (LPS) Príprava vzorky na FACS Y YYY Y Y Y YY YY YY Y Y Y Pretrepať (vortexovať) Y Y Y Y Y Y Y 30min. inkubácia tma lab. teplota Y Y Y Y Y Vzorka krvi 45µl Pipetovať MIX potrebných MPL Vzorka krvi 45µl + MPL Voľné MPL - väzba na receptory Plná krv značená MPL Erytrocyt Lymfocyt Debries? Príprava vzorky na FACS Lýza erytrocytov • Erytrocyty prítomné vo vzorke zahlcujú meranie (obraz je ťažko odčítateľný), preto po značení plnej krvi MPL je nutné previesť lýzu erytrocytov • K vzorke sa postupne pridáva:  Roztok A: 600ul  Príprava roztoku A: 1,5 l destilovanej vody + 1,8 ml 99% kyselina mravenčia – spôsobuje lýzu erytrocytov v kyslom prostredí  Roztok B: 300ul  Príprava roztoku B: 1,5 l destilovanej vody + 9,0 g bezvodého Na2CO3, 21,75 g NaCl, 46,95 g bezvodého Na2SO4 – alkalický roztok = zastavenie lýzy a úprava pH  Roztok C: 100ul  Príprava roztoku C.: 1,5 l PBS (pH 7-7,4) + 15 g paraformaldehydu – fixácia buniek Vzorky sa do začiatku merania uchovávajú v tme pri 4°C Automatický lyzátor TQ-prep od Firmy Beckman Coulter Flow+cyto+metria = „meranie buniek v pohybe“ • Možnosť analýzy mnohých vlastností a charakteristík na úrovni jednej bunky počas krátkeho časového úseku • Dnešné stroje umožňujú meranie súčasne viac než 25 markerov na jednej bunke Určovanie fenotypu buniek Monitorovanie odpovede na liečbu Výskum signalizačných dráh • Kľúčový nástroj pre výskum porúch krvotvorby Princíp FACS • Pri prechode častíc laserovým lúčom dochádza k rozptylu svetla a k fluorescencii naviazaných fluorochrómov • Svetelné signály sú prevedené na elektrické pomocou detektorov (PMT) • Na každej bunke je možné zmerať niekoľko parametrov zároveň (rozptýlené svetlo + fluorescencia) • Namerané dáta sa ukladajú a ďalej analyzujú Čo meriame??? • Lomené a odrazené svetlo - pri prechode buniek laserovým lúčom (paprskem) dochádza k jeho lomu a odrazu na bunečnom povrchu a bunkových organelách • Emitovanú fluorescenciu – pokiaľ použijeme MPL konjugované s fluorochromom • Častice veľkosti 0,2-150 µm - prokaryotické a eukaryotické bunky - vírové častice, baktérie, huby - komplexy Ag-Ab Laser MPL konjugovaná s Fluorochromom Bunka Emitovaná fluorescencia Lomené a odrazené svetlo Cytometer tvoria 3 hlavné systémy Fluidný systém transport častíc k laserovému lúču Elektronický systém prevod detekovaných svetelných signálov na signály elektronické, vyhodnocované počítačom Optický systém laser, zrkadlá, optické filtre Fluidika Zabezpečuje transport častíc (buniek) v prúde nosnej kvapaliny k laserovému lúču a ich odvod do odpadu – princip hydrodynamické fokusace Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013 Prietoková komora (prietoková cela)miesto, kde sú bunky v ideálnom prípade unášané jednotlivo za sebou a ožiarené laserovým lúčom Rez prietokovou celou: uprostred vzorka (bunečná suspenzia) unášaná nosnou kvapalinou (sheath fluid) Hydrodynamická fokusácia Vzorka Vzorka Nízky tlak vzorky Úzky prúd vzorky Menší prietok buniek Presnejšie meranie vhodné napr. pre DNA analýzu a meranie funkčných vlastností Vysoký tlak vzorky Široký prúd vzorky Zbieranie velkého počtu častíc vhodné napr. na Imunofenotypizáciu buniek Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013 - jav, ktorý zabezpečuje usporiadanie buniek jednotlivo za sebou - vzorka, napr. bunečná suspenzia je vyvedená doprostred Tzv. Sheath fluid (nosná kvapalina) - nosná kvapalina postupne strháva jednotlivé bunky a usporadúva ich do radu za sebou - tlak nosnej kvapaliny je nastavený výrobcom, meniť môžeme tlak vzorky (nastavenie rýchlosti prietoku buniek) Optika • Excitačná optika laser a systém šošoviek (čoček), ktoré zaostrujú a smerujú laserový lúč – pred ožiarením častíc • Zberná optika sústava šošoviek, ktorá vedie a rozdeľuje svetlo do rôznych vlnových dĺžok na príslušné detektory – odrazené a fluorescenčné žiarenie po ožiarení častíc Excitačná optika Zberná optika Band pass filtre Dichroické zrkadlá Long pass filtre (LP) Lasery – zdroj žiarenia - Každý cytometer obsahuje ako zdroj žiarenia laser - Dnes: najčastejšie využívané 3 až 4 lasery súčasne v jednom stroji - Každý laser má charakteristickú vlnovú dĺžku žiarenia → excitácia rôznych fluorochromov Emisný peak: Pri ožiarení fluorochromu lúčom lasera je emitované žiarenie určitej vlnovej dĺžky. Podľa najvyššej intenzity vlnovej dĺžky emitovaného žiarenia sa volí vhodný detektor pre daný fluorochrom. • Vo viacfarebnej prietokovej cytometrii dochádza k emisii niekoľkých fluorochromov naraz – tj. je emitované žiarenie rôznych vlnových dĺžok a je nutné takto vzniknuté žiarenie rozdeliť tak, aby bolo jasné, čo vyžarujú jednotlivé fluorochromy. • Pri výbere fluorochromov sa v prietokovej cytometrii postupuje tak, aby sa emisné spektra vo svojich píkoch neprekrývali. • K rozdeleniu emitovaného žiarenia slúžia filtre Zber optického signálu v prietokovej cytometrii Elektronika • Svetelné signály sú prevádzané na elektrické • Typy detektorov: - lavinové fotodiódy: detekcia FSC - fotonásobiče PMT (PhotoMultiplierTube): detekcia SSC a fluorescencie PMT - veľmi citlivé, sú schopné zachytiť i slabé signály - zvyšujú signál primárneho dopadajúceho žiarenia Princíp PMT Žiarenie vo forme fotónov dopadá na fotokatódu. Z nej sú na základe fotoelektrického javu vyrazené eletróny, ktoré sú ďalej usmernené na tzv. dynódy (katódy z pozitívnym napätím). Na jednotlivé dynódy je privádzané stále vyššie napätie, čo umožňuje urýchlenie elektrónov a zvýšenie ich energie. Urýchlené elektróny majú dostatok energie na vyrazenie ďalších elektrónov z povrchu dynód. Počet elektrónov exponenciálne rastie. Vzniknuté elektróny dopadajú na koniec na anódu, na ktorej dochádza k vzniku napäťového pulzu. PMT umožňuje premeniť slabý počiatočný signál na silný napäťový pulz. Vznik napäťového pulzu / Intenzita fluorescencie - prechod bunky laserovým lúčom generuje vznik napäťového pulzu na detektore - veľkosť napäťového pulzu je daná intenzitou žiarenia (intenzitou fluorescencie), ktoré dopadlo na PMT - intenzita fluorescencie závisí na: • expresii jednotlivých povrchových znakov • počte naviazaných fluorochromov • na sile fluorochromu (fluorochromy nevykazujú rovnakú intenzitu fluorescencie) - napäťovým pulzom sú pomocou prevodníkov pridelené digitálne hodnoty rozdelené do 0-1024 kanálov na základe veľkosti pulzu - každý z týchto kanálov odpovedá určitej intenzite fluorescencie Fluorescencia Veľa buniek má rovnakú alebo podobnú morfológiu- na základe expresie povrchových znakov ich vieme roztriediť do skupín - využívajú sa k tomu monoklonálne Ab značené fluorochromom špecifické k určitému epitopu - fluorochrom je molekula schopná absorbovať žiarenie špecifickej vlnovej dĺžky (excitácia) a následne vyžiariť kvantum energie (emisia) vo forme fluorescenčného žiarenia - čiastočná strana energie (premena na teplo) = Stokesov posun Fluorochrom - charakteristické excitačné a emisné spektrum - Stokesov posun je daný štruktúrou molekuly Veľkosť vs. granularita • Veľkosť a členitosť bunky určujeme na základe rozptylu žiarenia (light scatter): prechádzajúca častica vychýli dopadajúce žiarenie Forward Scatter (FSC) – rozptyl žiarenia v priamom smere → závisí na veľkosti buniek = určuje veľkosť Side Scatter (SSC) – rozptyl žiarenia do strán → závisí na členitosti buniek = určuje granularitu • Stačí jeden laser • Nie je to fluorescenčné žiarenie (nepotrebujeme MPL s fluorochrómami) FSC vs. SSC Lymfocyty Granulocyty Monocyty RBC, debris, mrtvé buňky veľkosť FSC SSC granularita Kombináciou FSC a SSC získavame rozlíšenie základných subpopulácií Leukocytov Veľkosť: lymfocyty < monocyty < granulocyty Granularita: lymfocyty < monocyty ≤ granulocyty Volíme 2 libovolné parametry vůči sobě (osa x a y) Volíme 1 vybraný parametr (osa x), na ose y je vždy parametr count (= počet buněk) DOT PLOT Intenzita fluorescencie Intenzita fluorescencie - každá bodka (tečka) zobrazuje 1 bunku a vyjadruje expresiu daného znaku na bunke - príklad grafu: Dot Plot rozdelený do 4 kvadrantov, na základe expresie sledovaných znakov: 1. CD19+ CD3- = B-lymfocyty (11,40% z Lymfocytov) 2. CD19+ CD3+ 3. CD19- CD3+ = T-lymfocyty (83,91% z Lymfocytov) 4. CD19- CD3- v jednotlivých kvadrantoch sa nachádzajú bunky s podobnou expresiou znakov 1. 2. 3.4. B-lymfocyty T-lymfocyty CD3- CD3+ CD19+ CD19- MPL Fluorochrom Percento buniek v jednotlivom kvadrante Výhody a nevýhody prietokovej cytometrie Výhody • Veľké množstvo analyzovaného materiálu – veľké množstvo dát • Analýza trvá niekoľko minút • Kvalitatívna + kvantitatívna analýza • Možné manipulačné operácie- napr. triedenie buniek s vybranými vlastnosťami (cell sorting) Nevýhody • Vysoká finančná náročnosť • Zostavenie experimentu, analýza a vyhodnotenie dát závislé na skúsenostiach obsluhy • Analýza vzoriek čo najskôr po odbere • Nevidíme lokalizáciu signálu na bunke Krvný diferenciál Základné vyšetrenie v imunologickom laboratóriu: stanovenie lymfocytárnych subpopulácií Pripravujú sa dve skúmavky: Sledujeme počet: Lymfocytov (GADJ); Monocytov (Mono); Eosinofilov (Eo); množstvo Debris (spád = mŕtve bunky) Krvný diferenciál Základné vyšetrenie v imunologickom laboratóriu: stanovenie zastúpenia lymfocytárnych subpopulácií v plnej krvi Prietokovou cytometriou sa stanovuje počet buniek v jednotlivých subpopuláciách leukocytov a porovnáva sa s tabuľkovými hodnotami. Pripravujú sa dve skúmavky s nasledujúcou kombináciou monoklonálnych protilátok MPL: Skúmavka A: 45µl krvi + x µl MPL CD45 FITC CD3 PC5 CD4 RD-1 CD8 ECD Skúmavka B: 45µl krvi + x µl MPL CD45 FITC CD3 PC5 CD19 ECD CD16/56 RD-1 MPL + Fluorochrom Rovnaké fluorochromy ale konjugované s inou MPL = musia byť rozdelené do dvoch skúmaviek Vzorky krvi s MPL sa inkubujú 25 min, nasleduje lýza erytrocytov a meranie na prietokovom cytometry Krvný diferenciál – gatovacia stratégia + výsledky Z oboch skúmaviek získame relatívny počet (%): Lymfocytov + Monocytov + Granulocytov Do výsledku sa zapisuje priemerná hodnota z oboch skúmaviek Skúmavka A Obsahuje: vzorka krvi + MPL (aCD45; aCD3; aCD4; aCD8) Získame relatívny počet: T-lymfocytov CD3+ Pomocných Th-lymfocytov CD3+ CD4+ Cytotoxických Tc-lymfocytov CD3+ CD8+ Skúmavka B Obsahuje: vzorka krvi + MPL (aCD45; aCD3; aCD19; aCD56) Získame relatívny počet: B-lymfocytov CD19+ NK buniek CD56+CD3- Eosinofilov Krvný diferenciál – výsledky Cytometrické meranie: Zo skúmavky A získame relatívny počet: CD3+ T-lymfocytov CD3+CD4+ pomocných Th-lymfocytov CD3+CD8+ cytotoxických Tc-lymfocytov Zo skúmavky B získame relatívny počet: CD3+ T-lymfocytov CD19+ B-lymfocytov CD16/56+ NK buniek eosinofilov Zo skúmavky A+B získame relatívny počet: Monocytov Lymfocytov Granulocytov Relatívny počet: percentuálne zastúpenie danej populácie buniek Absolútny počet: počet buniek na 1l krvi - Pomocou počítača leukocytov stanovíme počet leukocytov na 1l krvi - Z relatívneho počtu danej subpopulácie a absolútneho počtu leukocytov dorátame absolútny počet danej subpopulácie buniek Vo výsledkovom liste sa udáva relatívny a taktiež absolútny počet buniek jednotlivých subpopulácií a porovnáva sa s fyziologickými/tabuľkovými hodnotami Stanovenie absolútneho počtu lymfocytárnych subpopulácií Počet Leukocytov 4-10 x109l Lymfocyty 20-55 % Monocyty 0-10 % Granulocyty – neutrofily, eosinofily, bazofily 37-75 % Príklad: relatívny počet abs. počet Leukocyty 5 x109l Lymfocyty: 20% 1,0 x109l CD3: 75% 0,75 x109l CD19: 10% 0,1 x109l CD15,56: 15% 0,15 x109l Diferenciálny rozpočet Stanovenie relatívneho počtu leukocytárnych a lymfocytárnych subpopulácií pomocou prietokovej cytometrie SSC SSC CD45 FITC CD45 FITC CD45- panleukocytárny znak, prítomný na všetkých leukocytoch x+y+z = 100 % = Leukocyty x % Lymfocyty + y % Monocyty + z % Granulocyty x1 % T-lym. + x2 % B-lym + x3 % NK bunky x1+x2+x3 = 100 % = Lymfocyty x11 % CD4 Th + x12 % CD8 Tc x11 + x12 = 100 % = T-lymfocyty Základom imunologického vyšetrenia je krvný diferenciál, určenie základných leukocytárnych subpopulácií. V prípade patologických hodnôt je nutné merania doplniť s využitím iných MPL a bližšie charakterizovať možný patologický stav. Zdravá osoba CD3+CD3+ CD3+ CD8+CD4+ CD19+ CD16/56+ Fyziologické hodnoty: T LYMFOCYTY •CD3+ : 82 (58-85)% •CD3+ 4+: 57 (30-60)% •CD3+ 8+: 19 (15-35)% B LYMFOCYTY • CD19+ : 11 (7-23) % NK LYMFOCYTY •CD16,56+: 6 (6-20)% 6,37% Vyšetrenie lymfocytov periférnej krvi ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA LYMFOCYTECH PERIFERNÍ KRVE (%) CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos signálu 58-85 CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II, aktivace 30-60 CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I, aktivace 15-35 CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23 CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor adheze 6-20 HLA-DR B-lymfocyty, monocyty, aktivované T-lymfocyty MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na všech B-lymfocytech), T-lymfocyty 3-7 (na aktivovaných T-lymfocytech) ZNÁT!! Príklady využitia FACS v praxi Vplyv infekcie Bakteriální infekce • Počet leukocytů:  Th: CD3+ 4+:  • Lymfocyty:  Monocyty: CD14+HLA DR+ :  • Granulocyty:  Virová infekce • Počet leukocytů:  Tc: CD3+ 8+:  • Lymfocyty:  CD3+8+HLA DR+ :  • Granulocyty:  CD3+8+38+ :  Pacientka: Ž, *1957 - v krvnom diferenciáli chýbajú B-lymfocyty (0,0 % z celkových lymfocytov) - v nemocničnom systéme zistená liečba rituximabom – pacientka reumatológie - výsledok: deplécia B lymfocytov vplyvom liečby (po 4-6 mesiacoch návrat k normálnym hladinám) - odber a meranie nutné opakovať po niekoľkých mesiacoch X-viazaná agamaglobulinémia • mutácia v géne kódujúcom Brutonovu tyrosinkinázu – dôležitá pre diferenciáciu B lymfocytov • ženy prenášačky, manifestácia u mužov • dochádza k zastaveniu vývoja B lymfocytov • neprítomnosť B lymfocytov v krvnom obehu - v krvnom diferenciáli chýbajú B-lymfocyty (0,0 % z celkových lymfocytov) - zastúpenie ostatných lymfocytárnych subpopulácií v norme - výsledok: Krvný diferenciál: X-viazaná agamaglobulinémia T LYMFOCYTY •CD3+ : 59 (58- 85)% •CD3+ 4+: 41 (30- 60)% •CD3+ 8+: 15 (15- 35)% B LYMFOCYTY • CD19+ : 0 (7-23) % NK LYMFOCYTY •CD16,56+: 34 (6-20)% 41% 15% 0% 34% 59% 59% Pacient: M, *1966 - v krvnom diferenciáli vysoké B-lymfocyty (95,50 % z celkových lymfocytov) - Prvo-záchyt: bez histórie v nemocničnom systéme - výsledok: podozrenie na leukémiu - nutné doplniť vyšetrenie CD5+CD19+ buniek Doplnenie vyšetrenia na zistenie prítomnosti CD5+CD19+ buniek CD5+CD19+ : 94.8% - CD5+CD19+ bunky = marker chronickej lymfoproliferatívnej choroby - u zdravej osoby sa znak CD5 vyskytuje na T-lymfocytoch, normálne hodnoty CD5+ na B-lymfocytoch u zdravého dospelého človeka: do 10% zo všetkých B-lymfocytov Pacient: M, *1966 Výsledok: vysoký počet CD5+CD19+ = odporúčanie na hematoonkologické vyšetrenie Vzorka: periférna krv odobraná do EDTA Značenie MPL: CD45 KO- panleukocytárny znak CD19 PC7- B-lymfocyty CD5 FITC Pacient: M, *1999 - v krvnom diferenciáli zistený obrátený pomer CD3+CD4+ k CD3+CD8+ (13,2 : 50,9) - Fyziologické hodnoty: pomer CD3+CD4+ > CD3+CD8+ - Prvo-záchyt: bez histórie v nemocničnom systéme - výsledok: podozrenie na vírovú infekciu - nutné doplniť vyšetrenie CD8+CD38+ buniek SCID - Severe Combined Immunodeficiency Ťažká kombinovaná imunodeficiencie • Primární imunodeficience (vrozená), postižena je buněčná složka imunity • Jedná o nejzávažnější vrozenou imunodeficienci (záhy po narození těžké infekce) • Bez léčby (transplantace kostní dřeně) úmrtí v prvním roce života (vyvíjí se také genová terapie) • Klinické projevy: • Infekce způsobené atypickými patogeny (pneumocysty, kandidózy, atypické mykobakteriózy, cytomegalová pneumotitida) • Chronické průjmy (bez průkazu etiologického agens), neprospívání, kožní infekce, komplikace po vakcinaci BCG • Molekulární podstata je heterogenní, rozlišuje se několik skupin SCID: 1. Porucha ADA (adenosindeaminázy): Dysfunkce nebo absence tohoto enzymu způsobuje akumulaci produktů metabolismu purinů, které jsou pro časné thymocyty toxické  rozvíjí se těžká T lymfopenie 2. SCID T-B-: Absence T i B lymfocytů, NK buňky zachovány. Molekulární podstata heterogenní (některé případy deficit rekombinázy RAG-2, porucha exprese receptoru pro IL-7) 3. SCID T-B+: Chybí T lymfocyty a NK buňky, B lymfocyty zachovány. Nejčastější forma SCID (60% všech případů). 70% případů vázáno na chromosom X – mutace genu pro gama řetězec receptoru pro IL-2. Tento gama řetězec je ale společný i receptorům pro IL-4, IL-7, IL-9 a IL-15  funkční porucha mnoha cytokinů. 4. Retikulární dysgeneze: Postižení kmenové buňky, blokován vývoj myeloidní i lymfoidní linie. SCID Severe Combined Immunodeficiency – Ťažké kombinované imunodeficiencie Príklad pacienta s SCID - záchyt u novorodencov a detí - nízky absolútny počet Leukocytov a Lymfocytov, v podstate chýbajú CD3+ T-lymfocyty, počet B-lymfocytov a NK buniek môže byť taktiež znížený Leukocyty: 5,0x10*9/l Lymfocyty: 4,0x10*9/l 8% 2% T LYMFOCYTY •CD3+ : 14 (58-85)% •CD3+ 4+: 8 (30-60)% •CD3+ 8+: 2 (15-35)% Nízký počet leukocytů i lymfocytů vzhledem k věku pacienta Velice nízký počet T-lymfocytů!! SCID Severe Combined Immunodeficiency – Ťažké kombinované imunodeficiencie 71% 13% B LYMFOCYTY • CD19+ : 71 (7-23) % NK LYMFOCYTY •CD16,56+: 13 (6-20)% Výsledok: možné doplniť funkčný test proliferácie T-lymfocytov; dieťa je smerované k transplantácii kostnej dreni SCID Leu : 5,0x109/l Ly: : 4,0x109/l T LYMFOCYTY •CD3+ : 14 (58-85)% •CD3+ 4+: 8 (30-60)% •CD3+ 8+: 2 (15-35)% B LYMFOCYTY • CD19+ : 71 (7-23) % NK LYMFOCYTY •CD16,56+: 13 (6-20)% 8% 2% 71% 13% 14% 14% Výsledok: T-B+NK+ SCID Poznámka: všetky jaderné T-lymfocyty boli materské, aktivované, vyvolávajúce reakciu štěpu proti hostiteľovi. HLA-B27 negatívny pozitívny Znak HLA-B27 je asociovaný s radou nešpecificky zápalových ochorení, akými sú zápaly kĺbov, vnútorných štruktúr oka (uveitida), krátkych kostí rúk, nôh a šliach, ďalej psoriázou, chronickými bolesťami spodnej časti chrbta (zad) a spondyloarthropatiou, z ktorej najznámejšou je ankylózujúca spondylitida (zápalové systémové ochorenie osového skeletu a kĺbov – Bechtěrevova choroba) Vzorka: periférna krv odobraná do EDTA Značenie MPL: CD3 PE- T-lymfocyty HLA-B27 FITC Výsledok: cytometrické vyšetrenie HLA-B27 je len screeningová metóda, pozitívny výsledok sa vydáva s odporúčaním na genetické vyšetrenie Vyšetrenie HLA-B27 nie je doplňujúcim meraním ku krvnému diferenciálu, je to samostatné meranie Folded man https://www.youtube.com/watc h?v=1ycLWc4bRtg&ab_channel= SouthChinaMorningPost Bronchoalveolárna laváž - BAL • diagnostické bronchoskopické vyšetrenie • pacientovi sa do bronchu (vetvy bronchu) pomocou fibrobronchoskopu aplikuje a následne späť aspiruje 150- 200 ml fyziologického roztoku • sleduje sa zastúpenie množstva a percentuálneho podielu jednotlivých typov leukocytov • indikuje sa u zápalových pľúcnych ochorení, nádorových ochorení, intersticiálnych pľúcnych procesoch, pneumokoniózach - vzorka: bronchoalveolárna tekutina - Spracovanie: - filtrácia vzorky kvôli prípadnému obsahu nečistôt, tkanív, premytie, značenie MPL: CD45 FITC – panleukocytárny znak CD3 PC5 – T-lymfocyty CD4 RD1 – Th- lymfocyty CD8 ECD – Tc-lymfocyty Pozn. Vzorka BAL nesmie obsahovať krv. V krvi je iné zastúpenie lymfocytárních subpopulácií ako v BAL, v prípade „znečištěnia“ BAL krvou nie je možné rozpoznať, ktoré lymfocyty pocházajú z krvi a ktoré z BAL, čo vedie k znehodnoteniu vyšetrenie. Bronchoalveolárna laváž - BAL v v - Diagnosticky dôležitý je pomer CD3+CD4+ k CD3+CD8+ T-lymfocytov (= imunoregulační index) - Fyziologické hodnoty: pomer CD3+CD4+/CD3+CD8+ = 1,1 až 3,5 - Patologické hodnoty: - výrazná prevaha pomocných CD4+ T-lymfocytov = podozrenie napr. na sarkoidózu, pneumóniu, nádory dýchacích ciest,... - prevaha cytotoxických CD8+ T-lymfocytov = podozrenie na hypersenzitívnu pneumonitídu,... CD4-RD1 CD8-ECD CD4-RD1CD8-ECD CD8- CD4- Hodnotenie nálezu jednotlivých subpopulácií Snížení/ zvýšení subpopulace onemocnění  CD19+, CD3+, CD4+, CD8+ při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii)  CD19+ u některých pacientů s CVID  CD19+ B – buněčná leukémie  CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi  CD3+ T – buněčná leukémie  CD4+ u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable immunodeficiency) - virové infekce (EBV, CMV, HIV)  CD4+ autoimunity, alergie  CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systémový lupus erythematodes-SLE)  CD8+ u některých pacientů s CVID - virové infekce (EBV, CMV, HIV)