Žlutý kopec 7, 656 53 Brno
www.mou.cz
T
@
Poskytovatel zdravotních služeb akreditovaný Organizací
evropských onkologických ústavů (OECI) a Českou
společností pro akreditaci ve zdravotnictví.
Parametry metody na automatickém
analyzátoru
Andrea Wagnerová
+420 543 136 704
andrea.wagnerova@mou.cz
2
Biochemický analyzátor
 dle definovaného algoritmu provádí jednotlivé kroky analýzy (transport vzorku,
pipetování vzorku, dávkování reagencií, míchání, inkubace, měření absorbance,
výpočet výsledné koncentrace)
 součástí bch analyzátorů je tzv. ISE modul (Na, K, Cl)
 Současné moderní bch analyzátory patří do generace diskrétních selektivních
analyzátorů, které pracují po vzorcích pacientů a umožňují výběr metod.
3
Součásti analyzátoru
Vzorkový pipetor: skládá se z ramene pipetoru a vzorkové jehly (přenáší vzorek na
dno reakční kyvety), součástí této jehly je detekční systém pro detekci hladiny a
sraženiny.
Mycí stanice: vzorková jehla i reagenční pipetory jsou oplachována z vnějšku i
zevnitř před nasátím nového vzorku/reagencie.
4
Součástí analyzátoru II
Reagenční prostor: chlazený prostor pro uložení reagencií
Reagenční pipetory: dávkují reagencie do reakční kyvety (vypouštění nad reakční
kyvetou)
Ultrazvukové míchačky: promíchání reakční směsi (homogennost směsi)
Inkubační lázeň: naplněna deionizovanou vodou, 37 °C
5
Součásti analyzátoru III
Fotometr: k měření absorbancí reakční směsi v kyvetě
Paprsek ze zdroje světla prochází kyvetou se vzorkem, poté monochromátorem,
dopadá na detektor diodového pole (pole fotodiod). Je zaznamenána změna
absorbance reakční směsi (na základě parametrů metody) a vypočítán výsledek.
Naměřená absorbance je přímoúměrná množství sledovaného analytu ve vzorku.
U každé kyvety je před reakcí změřena absorbance (0, tzv. blank → voda).
6
Součásti analyzátoru IV
ISE prostor: pro analýzu Na, K, Cl
Stanovení sodíku, draslíku a chloridů na základě rozdílu potenciálů jednotlivých
iontově selektivních elektrod a referenční elektrody.
7
Parametry metody
 nutné pro analytickou definici metody
Nastavení v analyzátoru:
 manuálně (dnes již méně využívané),
 instalace metody stažením konkrétních parametrů z aplikace výrobce.
8
Příklady parametrů metody
Typ vzorku: sérum/plazma, moč, CSF
Pipetovací objem vzorku: 1,5–35 µL
Pipetovací objem reagencií: 5–180 µL
Reakční teplota: 37 ± 0,1 °C
Vlnové délky: běžně 12 vlnových délek (340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570,
600, 660, 700, 800 nm)
Optický režim: monochromatický, bichromatický
9
Sledování reakce
 absorbance v reakční směsi je měřena během celé doby reakce (každých 8
sekund)
 u každé kyvety je také změřen blank s vodou (absorbance 0)
 pro výpočet koncentrace může být využito více měřících bodů
Průběh reakce (Uživatelská příručka Roche Diagnostics)
10
Měření v konstantním čase
Měří se absorbance za určitý časový úsek (po uplynutí určité doby). Je možné využít
zastavení reakce přidáním inhibitoru po inkubaci vzorku. Automatický analyzátor
měří absorbanci v definovaném intervalu, tj. od času 0 do 10 apod.
0
2
4
6
8
10
12
0 1 2 3 4 5 6
A
min
11
Dvoubodové měření (bichromatické)
Je obdobou měření v konstantním čase. Měření nezačíná však v čase 0, tj. na
počátku reakce, ale až po uplynutí určité doby, v měřicím bodě P1 (těsně po přidání
vzorku).
Při analýze na automatických analyzátorech je běžně využíváno dvoubodové
měření:
 první měřící bod je po přidání vzorku,
 druhý měřící bod po určité době (konstantní čas)
nebo po dosažení rovnováhy (end point).
0
2
4
6
8
10
12
0 1 2 3 4 5 6
A
min
P1
P2
12
Dvoubodové měření
Měření při dvou vlnových délkách.
Výsledná hodnota měření se vypočítá z rozdílu absorbance obou měření, je tak
kompenzována:
 variabilita světelné emise,
 citlivost fotodiody,
 částečky („nečistoty“) při průchodu světla.
Hlavní vlnová délka je dána absorpčním maximem reakční směsi.
13
Dvoubodové měření
 vlnová délka v oblasti absorpčního maxima
 vlnová délka mimo absorpční maximum
Využití:
 pro reakční směs, ve které se vyskytuje látka, která rovněž absorbuje záření o
vybrané vlnové délce (tzv. interferující látka),
 zamezení falešně zvýšeného výsledku měření.
14
End-point metoda
K měření dochází po doběhnutí reakce nebo jejím zastavení.
Reakce dosáhne po určité době tzv. koncového bodu (end-point). Měří se hodnota
absorbance dosažená v tomto koncovém bodu po různě dlouhé inkubaci, která se
pak již nemění.
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 10 20 30 40 50 60 70 80
A
s
15
Kinetická metoda
Stanovení, při němž se stanovují parametry v průběhu reakce, tj. absorbance je
měřena opakovaně v průběhu reakce.
Je vybrán časový úsek, kdy je narůst absorbance lineární. Rychlost změny je přímo
úměrná koncentraci analytu vzorku, která je analyzována.
Také známá jako rate měření.
 pokles nebo nárůst absorbance za časovou jednotku (nejčastěji 1 min)
 podmínkou pro kinetické měření je lineární průběh závislosti absorbance na čase
 např. ALT, AST
16
Kalibrace
Činnost, která za specifikovaných podmínek v prvním kroku stanoví vztah mezi hodnotami veličiny s nejistotami měření
poskytnutými etalony a odpovídajícími indikacemi s přidruženými nejistotami měření a ve druhém kroku použije tyto informace
ke stanovení vztahu pro získání výsledku měření z indikace (VIM3).
 u bch analyzátorů slouží k sestrojení kalibrační křivky (standardy o různé
koncentraci)
Provádí se: při zavedení metody, nové šarže reagencií, zásah do optické části
analyzátoru, v souladu s požadavky na frekvenci kalibrace metody dané výrobcem
17
Lineární závislost
 kalibrační křivku představuje přímka
Měříme standardní roztoky (roztoky o známé koncentraci) se vzrůstající koncentrací
stanovovaného analytu.
Obrázek: Přímka (příklad 2 bodové kalibrace metody CREA, Roche)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 100 200 300 400
A
c
18
Výpočet koncentrace
Je-li kalibrační křivka lineární, je možné vypočítat neznámou koncentraci
stanovovaného analytu ve vzorku.
Cvz = Avz × cst
Ast
Vyjádřením kalibrace je kalibrační faktor, můžeme zjistit koncentraci analytu pomocí
faktoru.
Kalibrační faktor f: f = c/A. Upravenou rovnicí pak lze vypočítat koncentraci
stanovovaného analytu ve vzorku: c = A×f.
19
Nelineární závislost
 kalibrační křivku představuje křivka odlišná od přímky
Obvykle se používá standardní roztok o nulové koncentraci stanovovaného analytu
a 5 dalších standardů pro celý pracovní rozsah metody.
Obrázek: Spline křivka (příklad kalibrace metody CRP, Roche)
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 50 100 150 200 250 300 350
A
c
Nelineární závislost
20
Měřicí rozsah metody
Soubor hodnot veličin stejného druhu, které mohou být měřeny daným měřidlem
nebo měřicím systémem se specifikovanou přístrojovou nejistotou za definovaných
podmínek.
• v jakém koncentračním rozsahu lze měřit a v jakém rozsahu je kalibrační
závislost lineární
Mez detekce (LOD): nejmenší množství analytu, které lze spolehlivě prokázat
Mez stanovitelnosti (LOQ): nejnižší množství analytu, které lze s definovanou
přesností ještě stanovit nebo nejnižší bod kalibrační křivky
21
Průběh kalibrační křivky
Lineární průběh: pro sestrojení kalibrační křivky se využívá kalibrátoru s nulovou
hodnotou stanovovaného analytu a kalibrátorů s určitou hodnotou tohoto analytu. U
metod, kde byla lineární závislost opakovaně ověřena, lze využít kalibraci s nižším
počtem kalibrátorů, např. 2.
Nelineární průběh: používá se kalibrátor o nulové hodnotě stanovovaného analytu a
(minimálně) pět dalších standardních roztoků (kalibrátorů) s koncentracemi
pokrývajícími pracovní rozsah.
22
Lineární oblast kalibrační křivky
Lineární oblast
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 50 100 150 200 250 300 350
A
c
Při kvantitativních výpočtech musí být použito takové ředění vzorku, aby leželo v lineárním úseku křivky.
Vzorky ležící nad lineárním úsekem křivky závislosti se musí zředit a znovu analyzovat.
23
Hook efekt
„nadbytek protilátek“
Při vysokých koncentracích stanovovaného analytu mohou být vazebná místa
saturována antigenem a protilátka nemůže vytvářet komplex Ag x Ab. Výsledky
analýzy jsou podhodnocené.
Analyzátory mají různé postupy, jak Hook efekt rozpoznat, např. přidání více Ag do
rekce v případě, že narůst reakční křivky je příliš rychlý (odpovídá vysoké
koncentraci stanovovaného analytu).
24
Hook efekt II
Po proběhlé reakci přístroj do vzorku přidá opět antigen.
Zvýšení absorbance po přídavku Ag: měření proběhlo v oblasti nadbytku protilátky
(tvoří se nové imunokomplexy) → pro výpočet koncentrace analytu lze použít
naměřené hodnoty absorbance a původní měření.
Bez nárůstu absorbance po přídavku Ag: protilátka byla spotřebována (mnoho
antigenu) → analýza musí být opakována s vyšším ředěním vzorku.
25
Základní metrologické pojmy, ověření metody
 Mezinárodní metrologický slovník, nyní VIM3
Anglický termín Český ekvivalent (dříve)
Measurement trueness pravdivost měření
Measurement accuracy správnost měření
Measurement precision přesnost měření
Český ekvivalent
(terminologie VIM3)
pravdivost měření
přesnost měření
preciznost měření
Tabulka 1: Změny v metrologickém slovníku
26
Přesnost měření
Je těsnost shody mezi naměřenou hodnotou veličiny a pravou hodnotou měřené
veličiny.
 přesnější měření = měření s menší chybou.
Termín přesnost měření se vztahuje k preciznosti i pravdivosti měření, tj. vlivu
náhodných i systematických chyb. Vztah mezi precizností a přesností měření:
precizní a přesné precizní a nepřesné neprecizní a přesné neprecizní a nepřesné
27
Preciznost měření
Je těsnost shody mezi indikacemi nebo naměřenými hodnotami veličiny získanými
opakovanými měřeními na stejném objektu nebo na podobných objektech za
specifikovaných podmínek.
 vyjádřena číselně mírami nepreciznosti, tj. např. směrodatnou odchylkou, CV za
specifikovaných podmínek,
 nemá vztah ke skutečné hodnotě,
 závisí pouze na náhodných chybách měření.
Specifikované podmínky: podmínky opakovatelnosti měření, mezilehlé preciznosti
měření, reprodukovatelnosti měření.
28
Preciznost měření
za podmínek
opakovatelnosti měření mezilehlé preciznosti měření reprodukovatelnosti měření
29
Opakovatelnost měření
Je souborem podmínek měření, který zahrnuje stejný postup měření, stejný
obslužný personál, stejný měřící systém, stejné pracovní podmínky, stejné
místo a opakování měření na stejném objektu v krátkém časovém intervalu.
Příkladem je opakování měření je měření jednoho analytu jednoho vzorku 10× těsně
za sebou.
30
Mezilehlá preciznost měření
Je souborem podmínek měření, který zahrnuje stejný postup měření, stejné místo
a opakování měření na stejném objektu nebo podobných objektech v rozšířeném
časovém úseku, ale smí obsahovat další podmínky zahrnující změny.
 změny mohou zahrnovat nové kalibrace, kalibrátory, obslužný personál, meřící
systémy
Příkladem je dlouhodobé měření referenčních materiálů, tj. měření referenčního
materiálu (tzv. kontrolního – každý den) jako součást IKK.
31
Reprodukovatelnost měření
Je souborem podmínek měření, který zahrnuje různá místa, obslužný personál,
měřící systémy a opakování měření na stejném nebo podobném objektu.
Příkladem je porovnání výsledků měření při analýze téhož kontrolního materiálu v
různých laboratořích, tj. porovnání výsledků v rámci EHK.
32
Zdroje
• Terminologie v oblasti metrologie_DEF.pdf (unmz.cz)
• Uživatelská příručka Roche Diagnostics
• Nezbeda P, Klinická biochemie, Analytická fáze
Žlutý kopec 7, 656 53 Brno
www.mou.cz
Děkuji za pozornost.
RNDr. Andrea Wagnerová