Izolace nukleových kyselin Typy metod • Extrakční/precipitační metody • Využívají rozdílné rozpustnosti • Fenol-chloroformová extrakce • Fenol = organické rozpouštědlo • Po centrifugaci proteiny v organické fázi, denaturované proteiny a zbytky buněk v mezifázi, NK ve vodné fázi • Po přidání ethanolu k vodné fázi se NK vysráží • Adsorpční metody • Využívají schopnosti NK adsorbovat na silikátový povrch • Komerční izolační soupravy (kolonky) • Další (např. magnetická separace, centrifugace v hustotním gradientu) Adsorpční metoda izolace NK 1. Lýza • Lýza buněk → uvolnění NK (QIAzol, QIAshredder) • Detergenty – narušují membránu buněk • Enzymy – degradují proteiny a nukleázy Adsorpční metoda izolace NK 1. Lýza 2. Navázání NK • Navázání NK na silikagel • Pufr s chaotropními solemi – v jejich prostředí narušena vazba molekul vody na silikát → místo vody se váží NK • Ethanol – podporuje navázání (dehydratace silikagelu) Adsorpční metoda izolace NK 1. Lýza 2. Navázání NK 3. Promývání • Zbavení se nečistot • Pufr s chaotropními solemi → odstraní proteiny • Ethanol → odstraní soli Adsorpční metoda izolace NK • Eluce NK ze silikagelu • U RNA voda bez RNáz (DNA pufr) 1. Lýza 2. Navázání NK 3. Promývání 4. Eluce Izolace DNA • Izolace nebuněčné cfDNA • QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen) • Ze séra (plazmy) • Izolace DNA z buněk • QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) • Izolace DNA z malých množství buněk • QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen) Izolace DNA/RNA • Izolace DNA/RNA/miRNA z buněk a tkání • Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit • Izolace DNA/RNA z parafínových bločků • Allprep DNA/RNA FFPE • Izolace DNA/RNA z buněk a tkání • Allprep DNA/RNA • Micro, Mini, 96 well Izolace RNA • Izolace celkové RNA • RNeasy Mini Kit (Qiagen) • Materiál: buňky, tkáně • Micro, Mini QIAcube, Midi, Maxi, 96 well Izolace miRNA • Izolace celkové RNA obohacené o krátké RNA • Ze séra/plazmy • miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) • Z buněk a tkání • miRNeasy Mini Kit (Qiagen) – 50 mg tkáně nebo 1 x 107 buněk • miRNeasy Micro Kit (Qiagen) – 5 mg tkáně nebo 1 x 106 buněk • I 96 well miRNeasy Mini Kit (Qiagen) • Obsah skladujeme při pokojové teplotě (15-25°C) až 9 měsíců 1) K peletu buněk přidat 700 µl Qiazol pořádně třepat a vortexovat 30 s!!! (>3 x 106 buněk QIAshredder) • Fenol a guanidin thiokyanát- lýze, inhibice RNáz, odstranění buněčné DNA a proteinů 2) Inkubovat 5 minut při pokojové teplotě. (i déle) 3) Přidat 140 µl chloroformu a pořádně třepat a vortexovat 30 s!!! 4) Inkubovat 2,5 min při pokojové teplotě. 5) Centrifugovat 15 min / 12 000 g / 4°C. • Vodní (RNA) a organická fáze(proteiny) miRNeasy Mini Kit (Qiagen) 6) Odebrat 350 (2x 150+50) µl horní vodní fáze. 7) !Pozn.: Odebíráme opatrně pomalu od hladiny raději vícekrát po menších objemech. 8) Přidat 1,5 objemu (525 µl) 99,8% etanolu a promíchat opatrně pipetou. • Snižuje rozpustnost RNA a zvyšuje její dehydrataci -> lepší vazba na silikát 9) Přenést 700 µl směsi na RNeasy Mini Spin kolonku a centrifugovat 1 min / max. rychlost. Supernatant slít a provést ještě jednou se zbytkem vzorku. (Možnost přidat Dnázu) miRNeasy Mini Kit (Qiagen) 10)Promýt 700 µl RWT pufru a centrifugovat 1 min / max. rychlost. Supernatant slít. 11)Promýt 500 µl RPE pufru a centrifugovat 1 min / max. rychlost. Supernatant slít. • Pufry vymyjí nečistoty. 12)Opakovat krok 9, ale centrifugovat 2 min / max .rychlost. 13)Přenést RNeasy Mini Spin kolonku do nové 2 ml eppendorfky a centrifugovat 1 min / max. rychlost. miRNeasy Mini Kit (Qiagen) 14)Přenést kolonku do nové 1,5 ml RNase-free eppendorfky a přidat 30 µl RNase-free vody do středu kolonky. 15)Nechat stát cca 1 min a centrifugovat 1 min / max. rychlost. • Uvolní se vazba RNA-silikát 16)Ihned přemístit na led a změřit koncentraci a čistotu izolované RNA obohacené o krátké miRNA pomocí spektrofotometru NanodropND1000 a vzorek uskladnit při -80°C. Co se může pokazit • Neúplné rozdělení fází • Velké množství vstupného materiálu -> přehlcení kolonky • Kontaminace Rnázami • Špatně odebraná vodní fáze