PCR PCR 1983 Kary Mullis 1993 Nobelova cena PCR Cyklické střídání fází denaturace, annealingu a extenze jednoduchou změnou teploty reakční směsi Polymeráza využívá syntetické primery ohraničující amplifikovaný úsek DNA Amplifikace DNA Základní komponenty reakce • voda • pufr • dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) • MgCl2 • Taq polymeráza • primers • templát Teplotní režim • 96ºC Iniciální denaturace • 96ºC denaturace • 40-72ºC annealing • 72ºC elongace • 72ºC závěrečná elongace • 4ºC zchlazení 30x Konvenční kvantitativní PCR -„End point“ stanovení • Kvalitativní odpověď YES/NO • Extenzivní validace, kontroly • Denzitometrie • Minimální rozptyl v parametrech reakce má obrovský vliv na množství amplikonu • Interní heterologní kontrola (housekeeping gene) •Viral load u HIV+ pacientů • Výskyt minimální reziduální choroby u onkologických pacientů Kvantifikace pomocí PCR „End point“ Elektroforéza v agarovém gelu + - Základní vybavení transluminátor cycler