IZOLACE RNA A REAL-TIME PCR Izolace DNA a RNA • Zisk DNA nebo RNA v dostatečném množství a čistotě • Kvalita rozhoduje o úspěchu dalších metod • Vliv metody na další použití RNA extrakce • Z čerstvého materiálu • RNA uskladněna v -80C nebo ve speciálních roztocích • Zpracovávat 10-20 vzorků • DNAse I ke zbavení kontaminace DNA RNA kontrola kvality • Vysoká čistota (bez kontaminací) • Vysoká integrita (bez degradace) • Jakékoliv nečistoty – inhibice PCR (proteiny) • OD 260/280 1.8-2.0 bez proteinů • OD 260/230 1.8-2.0 bez organických nečistot • RIN>7 • Konsistentně používat čistotu a integritu – redukce variability Čistota • 260/280 nm – 1,8 čistá DNA, 2,0 čistá RNA (nižší – proteiny, fenol) • 260/230 nm – 2-2,2 (EDTA, fenol) • Záleží na koncentraci – pokud moc nízká, čistota nebude dobrá Templát – Izolace RNA - Integrita (RNA Integrity Number – RIN) výpočet na základě 28S a 18S rRNA - Čistota (A260/280; A260/230), přítomnost PCR inhibitorů - Přesné určení koncentrace RNA - Celková RNA nebo mRNA? - Vhodnost metody, automatizace, výtěžek… RIN Reverzní transkripce (RT) • Proces přepisu RNA do cDNA (komplementární DNA) • Primery, reverzní transkriptáza, dNTP, pufr (Mg2+) • Primery: oligo dT, random hexamers, gene specific • Reverzní transkriptázy: HIV, AMV, MMLV RT • Hned po izolaci • Vždy stejné množství RNA do reakce a stejně přepsat • Kontroly: – no RT (kontrola kontaminace genomickou DNA) – no template control (kontaminace) 1952 Elektroforéza 1967 • Rekombinantní DNA • Objev DNA ligázy 1969 FISH 1970 • Restrikční endonukleázy • Reverzní transkriptáza 1972 Klonování 1973 In vitro konstrukce bakteriálního plazmidu 1975 Southern blot 1977 Sekvenování DNA 1980 Koncept RFLP 1981 Western blotting 1982 • Manipulace s genomem Drosophily – P elementy • Whole genome shotgun Molekulární technologie 1984 Pulzní gelová elektroforéza 1985 • PCR • DNA fingertyping 1987 • YACs • Místně cílená mutageneze 1988 Taq Polymeráza ChIP 1990 BLAST 1992 BACs 1995 Microarrays 1998 RNAi 2002 UCSC Genome Browser 2003 DNA assembly programs 2004 Anotace genů – ENSEMBL 2005 • Projekt HapMap • Ligační sekvenování 2006 Celogenomové metylační mapy 2007 miRNA 2009 Next Generation Sequencing What about DNA? • Maurice Wilkins-James Watson-Francis Crick- Rosalind Franklin, 1953 • Dr. Franklin died in 1958 • Nobelova cena Wilkins-Watson-Crick,1962 • model dsDNA King’s College London Southern blot, RFLP, … Northern/Western blot, Flowcytometrie, … Kultivace, biochemické analýzy Cytogenetické vyšetření Molekulární technologie 1. zda pacient nese nějakou klinicky významnou bodovou mutaci, která určuje jeho další léčbu? 2. který ze dvou genů je v nějaké tkáni exprimován více než druhý ? 3. druh patogenní bakterie u nemocného? 4. zastoupení leukemických buněk v krvi pacienta před a po léčbě? Jakým způsobem zjistíte: PCR Kary B. Mullis Praktická aplikace PCR 1987-8 • Použití termostabilní DNA polymerázy • Rozvedení konceptu navrženého K. Kleppem • Obrovský boom PCR díky technologickému pokroku • 363 629 článků (27.11.2008) • 399 022 (1.12.2009) • 428 622 (15.12.2011) Nobelova cena za chemii 1993 PCR Cyklické střídání fází denaturace, annealingu a extenze jednoduchou změnou teploty reakční směsi Polymeráza využívá syntetické primery ohraničující amplifikovaný úsek DNA Kvantifikace pomocí PCR Konvenční kvantitativní PCR -„End point“ stanovení • Kvalitativní odpověď YES/NO • Extenzivní validace, kontroly • Denzitometrie • Minimální rozptyl v parametrech reakce má obrovský vliv na množství amplikonu • Interní heterologní kontrola (housekeeping gene) •Viral load u HIV+ pacientů • Výskyt minimální reziduální choroby u onkologických pacientů Kvantifikace pomocí PCR „End point“ Kvantifikace pomocí PCR „End point“ Zásadní omezení – gelová elektroforéza • Nízká přesnost • Nízká citlivost • Malý dynamický rozsah – pouze 2log. • Nízké rozlišení, pouze na délce amplikonu • Není automatizovaná • Výstup není numerický – subjektivní hodnocení • EtBr – neváže se na DNA pravidelně • Post PCR zpracování - kontaminace Kvantitativní vztah mezi množstvím PCR produktu (amplikonu) a intenzitou fluorescence • Amplifikační práh detekce (Ct) Real – time detekce amplifikace Plateau fáze Exponenciální amplifikace pod úrovní pozadí Exponenciální fáze „end point“ „real-time“ Real-time Fluorescence Based PCR Real – time detekce amplifikace Fluorescence R je zajištěna např. vazbou fluorescenčního interkalačního barviva na DNA, použitím hydrolyzační sondy atd. Fluorescence reportérového fluoroforu je normalizována vůči pasivnímu fluoroforu (Rox) Rn. Změnu fluorescence v čase vůči pozadí udává Rn. (Rn=Rn+-Rn-). Threshold cycle „Ct“ – určený na základě hodnoty fluorescence pozadí (backround) a aktuální fluorescence vzorku – kvantitativní výstup pro každý vzorek Real – time detekce amplifikace - Ct Threshold Threshold cyclesBackground Fluorescence Threshold cycle „Ct“ - počáteční množství kopií templátu - definovaný v exponenciální fázi PCR - stejná účinnost PCR ve všech reakcích - účinnost štěpení fluorogenní sondy nebo vazby fluoroforu na DNA - citlivost detekce - čím menší Ct - tím větší počet kopií templátu na začátku reakce Real – time detekce amplifikace - Ct A CB A CB> > - rozdíl 1 Ct – dvojnásobné množství templátu 21 = 2 - kolika cyklům odpovídá odpovídá 10ti násobný rozdíl v množství templátu? (předpokládáme 100% účinnost PCR) 2n = 10 Threshold cycle „Ct“ Real – time detekce amplifikace - Ct 50 100 150 250 300 0 c [ng/l] Ct 50 28,16 100 27,16 150 26,66 250 26,06 300 25,66 n=3,32 Kontaminace PCR Cross contamination Carry-over contamination PCR 1 PCR 2 PCR 2PCR 1 Vzorek 1 Vzorek 2 Přenos amplikonu do dalších PCR Vzájemná kontaminace vzorků Jak předejít kontaminaci Kontaminace • Správná laboratorní praxe • Plastik v RNA kvalitě • Automatizace  www.millipore.com; www.appliedbiosystems.com Application note: Contamination-pipetting: relative efficiency of filter tips compared to Microman® positive displacement pipette. Nature Methods 3 June 2006