Experimentální modely
Doc. RNDr. Sabina Ševčíková, PhD
Babákova myelomová skupina
ÚPF LF
Historie
 2 st. n.l. Galen - pokusy na prasatech a primátech
 1242 Ibn Al-Nafis- cirkulace krve u savců
 18. století Lavoisier – morče – respirace
 1880- Pasteur – antrax ovcím
 1890- Pavlov a psi
 1880- Emil von Behring – záškrt – izolace a pokusy na morčatech
 1943- izolace streptomycinu z půdy a Feldman- léčba morčat
 1940- Salk a identifikace viru obrny a vakcína v roce 1955
Historie II
 1789 J. Bentham – první hnutí proti pokusům na
zvířatech
 1822 – v GB zákon na ochranu zvířat
 1876 – zákon na testování zvířat
Experimentální modely
 Zjednodušení reálného života
 Studium specifických otázek
 Dostupné kdekoliv (ATCC)
 Možnost opakování
 Opakování pokusu
 Opakování na více geneticky stejných jedincích
 Opakování v jiné laboratoři, jiné zemi
Experimentální model
 Jasná definice
 Snadno dostupný
 Snadno udržovatelný
 Pro popis obecnějších jevů
 Krátký životní cyklus
 Větší počet potomstva
 Etické problémy
Obvyklé druhy laboratorních zvířat
 Bezobratlí
 Saccharomyces cerevisiae
 Drosophila melanogaster
 Caenorhabditis elegans
 Danio rerio
 Obratlovci
 myš laboratorní (Mus musculus var.)
 potkan laboratorní (Rattus norvegicus)
 morče domácí (Cavia porcellus)
 křeček zlatý (Mesocricetus auratus)
 králík domácí (Oryctolagus cunniculus)
 pes domácí (Canis familiaris)
 kočka domácí (Felis catus)
 křepelka obecná (Coturnix coturnix)
 primáti (Macacus rhesus)
Množství „spotřebovaných“ zvířat
 celosvětově
 ~50 mil./rok
 Evropa
 ~12 mil./rok
výzkum
(15%)
testování
toxicity
(15 %)
testování
vakcín
(15 %)
farmaceutický
průmysl
(25 %)
další
[diagnostika,
exp. medicína,
výuka]
(30 %)
Kontroverze – použití zvířat
 pro
 většina pokroků v medicíně
20. – 21. století
 jsme jejich konzumenti
 lidé mají vůči sobě morální a
etické závazky, které nemají
vůči zvířatům
 proti
 kruté a neodůvodnitelné i
přes to, že z výzkumu
profituje člověk (mohlo by se
experimentovat na člověku)
 zvíře nemůže dát souhlas
 všechny živé organizmy vč.
Homo sapiens mají stejná
práva
Regulace používání lab. zvířat
 Zákon na ochranu zvířat 246/1992 Sb.
162/1993 Sb. 167/1993 Sb. 77/2004 Sb.
 Ústřední komise na ochranu zvířat
(ÚKOZ)
 Odborné komise při uživatelském
zařízení
 Oprávnění dle §17 zákona 246/1992 Sb.
 autoregulace
Prokaryota vs eukaryota
Escherichia coli
 Gram negativní bakterie
 V trávícím traktu
 Genom sekvenován (1997)
 Snadno rostou na definovaném médiu, resistence k antibiotikům
 Studium replikace, genové exprese, syntéza proteinů
 Plazmidy, proteiny
Plasmidy
 Malé kruhové DNA
 Možnost jejich namnožení v bakteriích
 Nesou gen pro resistenci k antibiotiku (selekce)
 Použití v genovém inženýrství
 Izolace pomocí kolonek
plasmid
Bakteriální DNA
Salmonella typhimorium
 Používána pro Amesův test
 Screening mutagenního potenciálu genotoxických chemických
látek
 Hodnocení biotransformačních produktů z krve a moči
 Enzymy excizní reparace
 Zvýšená permeabilita
 Zvýšená citlivost k mutagenním látkám
Tkáňové kultury
 Primární (přímo z těla)
 Sekundární (buněčné linie)
 Hlavně sekundární
 snadno se pěstují
 velké množství
 uniformní – proliferace, diferenciace, apoptóza, moderní metody
 optimalizace metod
 Testování různých látek
 Velké množství kultur – 10% CO2, médium, sérum, antibiotika,
…přesně definované podmínky
 Lidské, myší, krysí…
NB4 buněčná linie
 t(15, 17) – APL
 APL akutní promyelocytární leukemie
 Diferencují do granulocytů pomocí ATRA
 ATCC (American tissue and cell collection) – sbírka linií, mikroorganismů
 1989 izolována z 23-leté ženy s APL
HeLa buňky
 Buňky cervikálního karcinomu, 1957
 Henrietta Lacks, zemřela na karcinom
 Linie vytvořena bez souhlasu pacientky a nebyla anonymizována –
začátek hnutí
 Dr. Salk linii použil k testům obrny
 21.4.2023 – 120 096 studií na této linii
Eukaryontní modely
 Kvasinky
 Drosophila melanogaster
 Caenorhabditis elegans
 Arabidopsis thaliana
 Danio rerio
 Mus musculus
 Oryctolagus cuniculus domesticus
Saccharomyces cerevisiae
 První osekvenovaný eukaryontní organismus
 Roste na speciálních definovaných půdách
 Studium
 buněčného cyklu
 signálních drah
 opravy DNA
 replikace DNA
 RNA procesy
 136 719 článků na pubmed
 Jednohybridový a dvouhybridový screening (interakce DNAprotein,
protein-protein)
Buněčný cyklus
Buněčný cyklus - doopravdy
Drosophila melanogaster
 Studium genetiky a vývojové biologie
 Malá, snadno se chová, hodně potomstva, krátký
životní cyklus
 Jen 4 páry velkých polytenních chromozomů
 Genom osekvenován
 Velká homologie genů (sekvence lidských a muších
genů velmi podobný)
 Wing spot test- chemická látka v potravě,
inhalačně, akutně, chronicky
 Morgan 1933 Nobelova cena
Caenorhabditis elegans
 1998 sekvence známá
 Snadno se chová, dá se zamrazit, lehce se rozmnožuje
 1031 buněk u dospělého samce
 19 000 genů
 Vývoj, diferenciace, apoptóza
 2002- Nobelova cena - Brenner, Horvitz, Sulston za apoptózu
 2006-Nobelova cena - Fire, Mello - RNAi
 2008-Nobelova cena - Chalfie- GFP
Apoptóza
Apoptóza
RNA interference
 Sekvenčně specifické umlčování
exprese genů (mRNA nebo i
translace)
 Spouští endogenní RNA (miRNA) i
exogenní (siRNA)
 miRNA důležité ve vývoji,
apoptóze i patogenezi nádorů
GFP
 Green fluorescent protein
 1962 izolován z Aequorea Victoria
(Osamu Shimomura)
 1992 – naklonován (Douglas Prasher)
 1992 – exprimován in vivo (Martin
Chalfie)
 Fluorescenční značka genové exprese,
lokalizace proteinů v buňce
 Není toxický pro buňky
 Detekce pomocí mikroskopu
GFP in vivo
Arabidopsis thaliana
 Malý genom
 Snadno roste v laboratoři
 Identifikace genů pro vývoj rostlin, studium
metabolismu
 27 000 genů, 35 000 proteinů
 V současnosti Agrobacterium tumefaciens a detergent s
DNA – vnesení DNA do rostliny
Danio rerio
 Toxikologie
 Studie mutací genů
 Vývojová biologie, toxikologie, onkologie,
genetika, neurobiologie
 Rychlý embryonální vývoj
 Regenerace
 2009 sekvenace
 52 000 studií
Mus musculus
 Snadno se rozmnožují, snadno se chovají, snadná
manipulace
 99% homologie genů s lidskými
 Studium lidských chorob (APL, AML…)
 Studium interakcí léků
 Studium patogeneze nemocí
 Transgenní myši (nemají funkční gen, nebo je mutovanýpatogeneze
onemocnění)
 1,838,566 článků
Imunodeficientní myši
 Myši bez funkčního imunitního systému
 Skvělé modely na studium
 Vývojová biologie
 Neurodegenerativní onemocnění
 Nádorová biologie
 Studium imunity
Oryctolagus cuniculus domesticus
 Produkce protilátek
 Blíž lidem než hlodavci
 Krátký životní cyklus, hodně potomků
 Genom osekvenován
 Studium reprodukce
Primáti
 Obrna
 Mozek
 Toxicita
 AIDS
 neurobiologie
 Hodně kritiky
 Infekční choroby, vývoj vakcín, HIV a malárie
Studium autismu
CAR-T terapie
Proč jsou potřeba zvířecí modely?
 Jednobuněčné modely-skvělé pro preklinický výzkum ALE
nedostačující - buněčné interakce
 Dávkování léků - v organismu jiné mechanismy –
metabolismus, enzymy….
 Člověk - zhruba 200 typů tkání
 Řada vlivů- stravování, prostředí, životní styl, genetická
výbava
 Léky schválené jen pro určité rasy – gefitinib pro léčbu
nádorů plic u Asijských žen, které nikdy nekouřili
 Lék jen pro lidi s černou pletí – BiDil – srdeční selhání
Etické zásady – koncepce tří „R“
 REPLACEMENT – náhrada zvířat v pokusech pokud dosažený
výsledek je na stejné nebo vyšší úrovni (hlavně výuka)
 REDUCTION – redukce počtu zvířat výběrem vhodných metod,
uspořádáním experimentu, péčí o kvalitu zvířat, atd.
 REFINEMENT – snížení až úplné vyloučení bolestivých a
stresujících přístupů a experimentálních postupů
 1959 Russel and Burch
Proč je to nutné?
Historie thalidomidu
 1953 Chemie Grunenthal
 1957 distribuce
 Sedativum, proti ranní nevolnosti u těhotných
 Anti-angiogenní účinky
 Nebyl dostatečně otestován
 Zhruba 10 000 dětí takto narozených
 Některé z těchto dětí naživu – těžké zdravotní problémy
přibývající s věkem
Obrna
 Obrna jedna z nejhorších nemocí 20. století
 Postihla statisíce lidí, hlavně dětí
 Vyvolává paralýzu a smrt
 Landsteiner a Popper prokázali, že je infekční a možnosti
přenosu – opice
 Salk a Sabin vyrobili vakcínu prací na kuřatech a opicích
Obrna
Úmrtí dětí SIDS
 Studie na ovcích umožnili užívání steroidů u respiračních problémů
nedonošených dětí
 Poznatky a léčba SIDS pochází ze studií na krysách, myších, psech a
ovcích
Jak se změnilo testování léčiv?
 6 let preklinika, 8 let testování
 Tkáňové kultury
 Zvířecí modely
 Klinické testování I, II, III a IV fáze
 I - bezpečnost
 II- testovací protokol
 III- finální testování
 IV- post-approval studies
 2004 VIOXX stáhnut – zvýšené riziko infarktu a
mrtvice
Děkuji za pozornost