Bez názvu2 Bez názvu2 FG23_14 o3_3 FG23_07
•Přednášky z lékařské biofyziky
Biofyzikální ústav Lékařské fakulty
Masarykovy univerzity, Brno

Bez názvu2
Přístrojové metody molekulární biofyziky
•Přednášky z lékařské biofyziky
Biofyzikální ústav Lékařské fakulty
Masarykovy univerzity, Brno

Bez názvu2
•3
Obsah přednášky
•Biomolekulární vědy mají klíčový význam pro molekulární medicínu. Budeme se zabývat některými
zařízeními pro studium struktury, měření koncentrace (in-vitro i in-vivo), a pro studium vlastností
membrán.
•
•Nejdůležitější zařízení založená na interakci elektromagnetického záření s makromolekulami
–VIS, UV a IR spektrofotometry
–Ramanovy spektrometry
–Zařízení pro měření cirkulárního dichroismu
–Zařízení pro rentgenstrukturní analýzu
•Zařízení založená na jiných vlastnostech biomolekul (např. mechanických a elektrických)
–Elektroforéza
•Zařízení pro měření membránových potenciálů a koncentrace iontů v buňkách

Bez názvu2
•4
Nebudeme se zabývat….
•Zařízeními pro měření
–Osmolární koncentrace (měření je založeno na kryoskopii),
–Rychlosti difuze
–Viskozity (praktická cvičení)
•Přístroji pro stanovení sekundární a terciární struktury bílkovin a nukleových kyselin pracujícími
na elektrochemickém základě (je studována interakce makromolekul s elektrodami)
•Nukleární magnetickou rezonancí (umožňuje např. zjistit, jak je v molekule chemicky vázaný vodík –
zmíněno v přednášce o MRI)
•Elektronovou spinovou rezonancí,
•Centrifugami (jiná přednáška) atd.

Bez názvu2
•5
Biofyzika a biomolekulární výzkum
• Tento výzkum je orientován zejména na strukturální studie, jež umožňují porozumět např.:
•
ØSpecifičnosti enzymatických a imunologických reakcí
Ø
ØÚčinkům některých léků (např. cytostatik) na molekulární úrovni.
Ø
ØMechanismům pasivního i aktivního transportu
Ø
ØBuněčnému pohybu
Ø
Ø……………..

Bez názvu2
•6
•Zařízení založená na interakci elektromagnetického záření s makromolekulami

Bez názvu2
•7
Druhy spektrofotometrů
ØSpektrofotometry jsou laboratorní přístroje používané pro studium látek absorbujících nebo
emitujících infračervené, viditelné nebo ultrafialové světlo, včetně studia jejich chemické
struktury.
Ø
ØAbsorpční spektrofotometry: založeny na spektrální závislosti absorpce světla.
Ø
ØEmisní spektrofotometry: Zdrojem světla je sama analyzovaná látka, jež je injektována nebo
rozprašována do bezbarvého plamene. Emitované světlo prochází optickým hranolem nebo mřížkou, takže
můžeme získat celé emisní spektrum. Frekvence přítomné ve spektru umožňují identifikovat např.
přítomné ionty.
Ø
ØSpektrofluorimetry: emise světla je vyvolána světlem o vlnové délce kratší než je vlnová délka
světla emitovaného.

Bez názvu2
•8
Absorpční spektrofotometry: Lambertův-Beerův zákon
•Absorpční spektrofotometrie je založena na absorpci světla při průchodu vrstvou roztoku látky
pohlcující světlo. Jeho koncentrace může být zjištěna pomocí Lambertova-Beerova zákona:
•
•I = I0.10-ecx
•
•c je koncentrace rozpuštěné látky, x tloušťka vrstvy,  I0 původní intenzita světla, I je intenzita
světla po průchodu vrstvou. Konstanta e (epsilon, absorpční nebo extinkční koeficient) závisí na
vlnové délce světla, na rozpuštěné látce i rozpouštědle. Její hodnoty pro běžné chemické sloučeniny
lze nalézt v tabulkách. Tyto hodnoty jsou vždy udávány pro určitou vlnovou délku (obvykle absorpční
maximum). Číselné hodnoty tohoto koeficientu závisejí na tom, jak je vyjadřována koncentrace
rozpuštěné látky. Když použijeme mol.l-1, hovoříme o molárním absorpčním koeficientu.

Bez názvu2
•9
•Poměr intenzit světla prošlého a dopadajícího se nazývá transmitance (dříve transparence).
Dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance se nazývá absorbance A.
•S ohledem na L.-B. zákon je tedy absorbance přímo úměrná koncentraci rozpuštěné látky a tloušťce
absorbující vrstvy roztoku.
•A = e.c.x

Bez názvu2
•10
Druhy absorpčních spektrofotometrů
ØPodle konstrukce rozdělujeme spektrofotometry na jednopaprskové a dvoupaprskové.
Ø
ØU jednopaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází nejdříve srovnávacím a pak
měřeným vzorkem (kyvety obsahující roztoky musí být pohyblivé). U dvoupaprskových spektrofotometrů
jeden svazek světla prochází měřeným vzorkem a druhý srovnávacím vzorkem (blankem). Dvoupaprskové
přístroje umožňují podstatně rychlejší měření, avšak jsou dražší. U jednoduchých přístrojů je
nastavování vlnové délky světla ruční. U pokročilejších přístrojů se toto nastavování děje
automaticky, což umožňuje přímo získávat absorpční křivky, tj. grafy závislostí absorbance na
vlnové délce světla.

Bez názvu2
•11
spekol
•Jednopaprskový spektrofotometr
•Zdrojem světla (1) je žárovka s wolframovým vláknem. Její polychromatické světlo prochází
kondenzorem (2) a odráží se od zrcadla (3) na vstupní štěrbinu (4) monochromátoru (části 4 až 8,
plus 12). Světlo je soustřeďováno čočkou (5) na odrazovou optickou mřížku (6), která tvoří barevné
spektrum. Téměř monochromatické světlo je promítáno objektivem (7) na výstupní štěrbinu (8)
monochromátoru.

Bez názvu2
•12
spekol
•S mřížkou lze otáčet pomocí ovladače vlnových délek (12), čímž se zaměřuje světlo o určité vlnové
délce na výstupní štěrbinu. Svazek světla pak prochází kyvetou (9) se vzorkem. Intenzita prošlého
světla je měřena fotodetektorem (10, 11). Jeho signál je zesilován zesilovačem (13). Hodnota
absorbance je zobrazena na displeji (14). Intenzita světla prošlého srovnávacím roztokem je vždy
srovnávána s intenzitou téhož svazku světla prošlého měřeným vzorkem.
•Jednopaprskový spektrofotometr

Bez názvu2
•13
•Moderní UV/VIS/NIR spektrofotometr
uv spec_fig2%20diode%20array spec_fig1%20scanning
•Světlo jedné vybrané vlnové délky nebo i celé prošlé spektrum může být měřeno
•NIR = near infrared = blízká infračervená oblast

Bez názvu2
•14
Absorpční UV spektrofotometrie
ØUltrafialové (UV) světlo je absorbováno různými sloučeninami, zejména těmi, které mají konjugované
dvojné vazby. Jak bílkoviny, tak nukleové kyseliny silně absorbují UV světlo, což lze využít pro
jejich zkoumání.
•
–Aminokyseliny tryptofan a tyrosin mají absorpční maxima při přibližně 280 nm. Fenylalanin při 255
nm.
–
–Nukleotidy (dusíkaté báze) mají absorpční maxima v oblasti 260 - 270 nm.
–
–Chromofory – jejich absorpční vlastnosti se mění podle chemického složení prostředí.

Bez názvu2
•15
Absorpční spektra aminokyselin
•
•According: http://www.gwdg.de/~pdittri/bilder/absorption.jpg

Bez názvu2
•16
Hypochromní efekt (HE)
ØAbsorpce světla je ovlivňována dipólovými momenty chemických vazeb, které interagují s fotony.
Stochasticky (náhodně) orientované dipólové momenty (denaturovaná bílkovina) absorbují světlo lépe
než ve stavu uspořádaném (šroubovice). U bílkovin je HE způsoben peptidovými vazbami, které mají UV
absorpční maximum kolem 190 nm.
ØDvoušroubovice DNA absorbuje UV světlo lépe než DNA denaturovaná (neuspořádaná).
•
ØHelicita – relativní zastoupení uspořádaných částí makromolekuly

Bez názvu2
•17
Hypochromní efekt u kys. polyglutamové. Při pH 7 tento polypeptid tvoří stochastické (neuspořádané)
klubko (1), při pH 4 získává šroubovicovou strukturu (2).  Absorpční maximum peptidových vazeb je
snížené vlivem jejich prostorového uspořádání. e je molární absorpční koeficient a l je vlnová
délka UV světla. [dle: Kalous a Pavlíček, 1980]

Bez názvu2
•18
IR spektrofotometrie
ØInfračervené záření (IR) působí na rotační a vibrační stavy molekul. Složité molekuly mohou
vibrovat nebo rotovat mnoha různými způsoby (módy). Různé chemické skupiny (-CH3, -OH, -COOH,
-NH2 atd.) mají specifické vibrační a rotační frekvence, a proto absorbují IR světlo o specifických
vlnových délkách.
•
ØZ tohoto důvodu mají infračervená absorpční spektra mnoho maxim. Změna chemické struktury se
projevuje jako změna polohy těchto maxim ve spektru.

Bez názvu2
•19
IRspektrum CH2AsymStr CH2SymStr CH2ScissorBend CH3UmbrellaBend CH2Rock
Infračervené spektrum hexanu vyjádřené jako závislost transmitance na vlnočtu
http://www.columbia.edu/cu/chemistry/edison/IRTutor.html

Bez názvu2
•20
Ramanova spektrometrie
ØRayleighův rozptyl světla. Nastává interakce fotonů s molekulami, jež se projevuje jen velmi malou
nebo žádnou změnou vlnové délky. Intenzita rozptýleného světla závisí na molekulové hmotnosti a
také na úhlu rozptylu, což lze využít pro odhad tvaru makromolekul.
•
ØRamanova spektrometrie. Při rozptylu fotonů nastává malá změna (posun) vlnové délky, způsobená
malým poklesem nebo zvýšením energie rozptýlených fotonů během přechodu z původního do změněného
vibračního nebo rotačního stavu interagující molekuly. Tyto stavy se mohou měnit v důsledku
strukturálních změn molekul.
•
ØProto změny v Ramanových spektrech (intenzita signálu v závislosti na posunu vlnové délky nebo
odpovídajícímu vlnočtu) odrážejí konformační změny molekul.

Bez názvu2
•21
Ramanova spektrometrie
•Ramanovo spektrum polytenního chromosomu pakomára Chironomus.
Při zvolených vlnočtech lze uskutečnit ramanovskou mikroskopii. Vybuzeno laserovým světlem o vlnové
délce 647.1 nm.
•According to: http://www.ijvs.com/volume2/edition3/section4.htm
raman 2

Bez názvu2
•22
Otto6.tif (7235218 bytes)
•Mikrofotografie v normálním bílém světle
•(chromozom Chironomus Thummi Thummi)
•
•Konfokální ramanovská mikrofotografie zobrazující páteř DNA (vibrace při 1094 cm-1)
•
•Konfokální ramanovská mikrofotografie zobrazující alifatické řetězce v bílkovinách při 1449 cm-1
•podle: http://www.ijvs.com/ volume2/edition3/section4.htm
aaaHPA

Bez názvu2
•23
Optická rotační disperze
•Metodou optické rotační disperze (ORD) měříme závislost optické aktivity na vlnové délce světla.
Tato metoda však byla nahrazena citlivější metodou cirkulárního dichroismu (CD), která poskytuje
podobné informace.

Bez názvu2
•24
Cirkulární dichroismus (CD) - nepovinné
Ø Měření optické aktivity (schopnosti stáčet rovinu polarizovaného světla). Konformační změny
molekul mohou být sledovány jako změny optické aktivity při použití speciálního polarimetru.
Ø U metody CD srovnáváme absorbance levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla,
jehož vlnová délka je blízká absorpčnímu maximu bílkoviny.
Ø CD lze využít též pro studium struktury nukleových kyselin.
t1
•Obrázek ukazuje změny elipticity syntetického polypeptidu, obsahujícího dlouhé sekvence poly-glu,
po přídavku trifluoroethanolu (TFE), který zvyšuje podíl a-šroubovice.
http://www-structure.llnl.gov/cd/polyq.htm
elipticita

Bez názvu2
•25
Rentgenstrukturní analýza
•Krystalová mřížka působí na rentgenové záření jako optická mřížka na viditelné světlo. Nastávají
ohybové jevy a na stínítku se objevuje difrakční obrazec. Tyto obrazce mohou být matematicky
analyzovány, aby se získala informace o rozložení elektronů v molekulách tvořících krystal.
•http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/text_images/FG04_02aC.JPG
•
•
•
rtgdifrakce

Bez názvu2
•26
fig4b
•Mapa elektronové hustoty organické sloučeniny vypočtená z rentgenového krystalogramu

Bez názvu2
•27
Krystalogram B-DNA získaný v r. 1952 Rosalindou E. Franklinovou, na jehož základě Watson a Crick
navrhli dvoušroubovicový model struktury DNA.
watson crick xrayhelix franklin watson
•F
•W
•C

Bez názvu2
•28
Metody založené na měření mechanických a elektrických vlastností makromolekul
•Velikost a tvar makromolekul můžeme studovat na základě měření:
 Osmotického tlaku (velikost, přednáška ″Termodynamika a život″)
 Difuzního koeficientu (velikost, přednáška ″Termodynamika a život″)
 Viskozity (tvar, praktická cvičení)
 Sedimentace (velikost, přednáška ″Zařízení pro elektrochemickou analýzu. Pomocné laboratorní
přístroje ″
–
–Dále můžeme použít:
 Elektronovou mikroskopii a metody příbuzné, včetně AFM (velikost a tvar, přednáška ″Mikroskopie″)
 Chromatografii – molekulárně síťový efekt u gelové permeační chromatografie (chemie)
 Elektroforézu (konec této části přednášky)

Bez názvu2
•29
Zařízení pro elektroforézu
Electrophoresis
•http://library.thinkquest.org/C0122628/showpicture.php?ID=0064
•Gelová plotna
•Zdroj napětí
•Jamky v gelu pro vzorky
•Látkový knot
•Roztok elektrolytu

Bez názvu2
•30
Elektrochemické vlastnosti koloidů
•Koloidy jsou roztoky, které obsahují částice o velikosti 10 – 1000 nm. Některé molekulární i
micelární koloidy jsou polyelektrolyty s amfoterními vlastnostmi. Tyto amfolyty se chovají buď jako
zásady nebo kyseliny v závislosti na pH prostředí.
0
•U bílkovin se mění počet skupin –NH3+ a –COO-.

Bez názvu2
•31
Vznik elektrické dvojvrstvy na povrchu koloidní částice
•Dva mechanismy:
•
ØAdsorpce iontů (i u hydrofobních koloidů)
ØElektrolytická disociace (převažuje u hydrofilních koloidů)
•
•Dvojvrstva na povrchu částice se liší v koncentrovaných a zředěných elektrolytech.
•
•U zředěných elektrolytů můžeme v celé iontové atmosféře částice rozlišit stabilní, difuzní a
elektroneutrální oblast.
•
•Elektrokinetický potenciál – z (zeta)-potenciál

Bez názvu2
•32
o3_8

Bez názvu2
•33
Elektroforéza
ØElektroforéza – pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Při rovnoměrném přímočarém pohybu
sférické částice o poloměru r, je elektrostatická síla působící na částici v rovnováze se silou
tření, jež je dána viskozitou. Sílu tření lze vypočítat dle Stokesova vzorce:
•F = 6.p.r.h.v
•     kde v je rychlost částice a h je dynamická viskozita prostředí.
ØElektrické pole působí na částici silou:
•F = z.e.E
•     kde z je počet elementárních nábojů nesených částicí, e je elementární náboj (1,602.10-19 C)
a E [V.m-1] je intenzita elektrického pole v daném místě.
ØRychlost částice je pak v důsledku rovnosti obou sil:

Bez názvu2
•34
Elektroforetická pohyblivost
ØElektroforetická pohyblivost u nezávisí na intenzitě elektrického pole. Je definována jako podíl
rychlosti částice a intenzity elektrického pole. Platí:
•Poznámka. Elektroforéza s dodecylsulfátem sodným. Tato sloučenina, která nese jeden negativní
elementární náboj, se váže definovaným způsobem k bílkovinám a eliminuje jejich vlastní elektrický
náboj. Molekuly bílkovin se pak pohybují s různou rychlostí jen proto, že mají různou velikost
(poloměr).

Bez názvu2
•35
Měření membránových potenciálů
ØMembránové potenciály se měří s pomocí skleněných mikroelektrod, tj. skleněných kapilár s velmi
jemnou úzkou špičkou. Průměr otvoru na konci špičky musí být menší než 1 mm, aby nedošlo při
zavádění do buňky k jejímu významnému poškození. Vnitřní prostor špičky kapiláry je naplněn
roztokem KCl o koncentraci 3 mol.l-1. Jako elektroda srovnávací se používá elektroda
stříbrochloridová umístěná do mimobuněčného prostoru.
•
ØPro skleněné mikroelektrody je charakteristický vysoký vnitřní odpor (kolem 10 MW), takže
potřebujeme pro měření vysoce kvalitní zesilovače, abychom zamezili zkreslení měřeného napětí.

Bez názvu2
•36
Experimentální uspořádání pro měření membránových potenciálů kapilárními mikroelektrodami
•Pomocí skleněných mikroelektrod lze také měřit jiné elektrochemické parametry buněk a membrán,
např. koncentraci některých iontů. Mohou být připraveny jako elektrody iontově selektivní pro Na+,
K+, Ca2+, H+ …

Bez názvu2
•37
Metoda patch-clamp („terčíkový zámek“)
•Některé iontové kanály mohou být předem uzavřeny nebo otevřeny, náplň mikroelektrody může
obsahovat ligandy, schopné interagovat s iontovými kanály, a všeobecně jakékoliv látky, jež mohou
ovlivňovat funkci membrány. Tato metoda umožňuje studium aktivity jednotlivých iontových kanálů
nebo jejich malých skupin.
•Tupá skleněná mikroelektroda se přiloží k povrchu buňky nebo k části biologické či umělé membrány.
Otvor na konci mikroelektrody je zcela uzavřen „terčíkem“ membrány a měřená elektrická napětí nebo
proudy se proto týkají jen malého okrsku membrány, v němž se nalézá jen malý počet iontových
kanálů.

Bez názvu2 Bez názvu2
Autor:
Vojtěch Mornstein
Obsahová spolupráce:
Viktor Brabec, Carmel J. Caruana
Grafika:
Lucie Mornsteinová
Poslední revize: září 2015