Adobe Systems Biofyzikální ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno 1 Přednášky z lékařské biofyziky Mikroskopie Obsah přednášky Optická (světelná) mikroskopie Fyzikální principy mikroskopie Varianty optických mikroskopů Fázový kontrast Fluorescenční mikroskop Speciální optické mikroskopy Laserový konfokální skenovací mikroskop Superrozlišující mikroskopy Elektronová mikroskopie Transmisní elektronový mikroskop Skenovací elektronový mikroskop Mikroskopie skenující sondou Skenovací tunelový mikroskop ATM - Atomic force microscopy Prostorové rozlišení lidského oka ze vzdálenosti 25 cm je přibližně 14 čar na mm (odpovídá rozlišení dvou bodů vzdálených 0,07 mm od sebe). Lupa může toto rozlišení podstatně zvýšit (pro velké rozlišení potřebujeme velký průměr čočky a krátkou ohniskovou vzdálenost). Lupa však nemá dostatečně velké rozlišení pro studium mikrostruktury živé hmoty. První jednoduché mikroskopy byly vyrobeny v Nizozemí již na konci 16. století. Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) zdokonalil jeho konstrukci a použil mikroskop pro mnoho biologických pozorování. Sestrojení elektronového mikroskopu (ve 30. letech 20. století). Rozlišení se zlepšilo přibližně 1000x oproti dosavadním mikroskopům, takže bylo možno spatřit velké molekuly (řádově nm). Dnes můžeme pozorovat jednotlivé atomy. V zásadě můžeme použít jakékoliv vlnění pro zobrazení mikroskopických objektů. Jedinou podmínkou je, aby vlnová délka byla kratší než rozměry pozorovaného objektu – Difrakční bariéra. Optická (světelná) mikroskopie - Úvod První složené mikroskopy Robert Hooke 1635-1703 http://micro.magnet.fsu.edu Fyzikální principy mikroskopie Schéma mikroskopu a vlastnosti jeho optického systému Hlavní části: dvě soustavy spojných čoček - objektiv a okulár. Z hlediska kvality obrazu je nejdůležitější částí mikroskopu objektiv, který vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz. Pozorovaný objekt musí být umístěn mezi ohnisko a dvojnásobek ohniskové vzdálenosti objektivu (objektiv lze považovat za spojnou čočku s velmi krátkou ohniskovou vzdáleností – pro zajištění vysokého rozlišení). Mechanická část spojující objektiv s okulárem se nazývá tubus. Obraz vytvořený objektivem (umístěný hned za předmětové ohnisko okuláru) je pozorován okulárem jako jednoduchou lupou. Výsledkem je velmi zvětšený, převrácený a neskutečný obraz. Kondensor je optickým systémem soustřeďujícím světlo na pozorovaný objekt, zajišťuje jeho dokonalé osvětlení. Fyzikální principy mikroskopie Optické schéma a zvětšení mikroskopu F – ohniska, f – ohniskové vzdálenosti, y - předmět, y' – skutečný obraz předmětu tvořený objektivem, y'' – neskutečný obraz viděný v okuláru,  – optický interval mikroskopu. d – konvenční zraková vzdálenost (0,25 m),  – optický interval mikroskopu, fob a fok jsou ohniskové vzdálenosti objektivu a okuláru. Obsah obrázku objekt Popis byl vytvořen automaticky Fyzikální principy mikroskopie Objektivy mikroskopů http://www.microscopyu.com/articles/optics/objectivespecs.html Fyzikální principy mikroskopie Objektivy mikroskopů http://micro.magnet.fsu.edu/ Plan-apochromatická korekce optické vady. Objektiv je určený pro mikroskopy využívající fotoaparát nebo kameru k získání záznamu. Různé objektivy vybavené apochromatickou korekcí optických vad objektivu Korekce optických vad - Achro a Achromat (achromatické), Fl, Fluar, Fluor, Neofluar, Fluotar (fluoritové čočky, lepší odstranění kulové a barevné vady), Apo (apochromatické, nejvyšší stupeň korekce kulové a barevné vady), Plan- korekce zklenutí zorného pole (zaostření rovinného objektu v celém zorném poli mikroskopu) Fyzikální principy mikroskopie Sférické vady •http://apfyz.upol.cz/ucebnice/down/optmikro.pdf Sférické zkreslení způsobí deformaci přímek buďto na soudek (uprostřed) nebo na polštářek (vpravo) Fyzikální principy mikroskopie Barevné vady http://cs.wikiversity.org/wiki/MedFyz Rozklad bílého světla na barevné spektrum, objektivy jsou korigovány na 2-3 barvy, nejčastěji žlutá, zelená a červená oblast. Fyzikální principy mikroskopie Specifikace objektivů - numerická apertura (NA) Numerická apertura –určuje úhel, pod kterým může světlo vstupovat do objektivu (což určuje jas obrazu, čím je NA větší, tím je větší zorný úhel), NA = n·sin kde n je index lomu prostředí mezi objektivem a krycím sklíčkem a  je „zorný“ úhel. • Pro zvýšení NA se využívá imersní prostředí s vyšším indexem lomu n než má vzduch nvzduch = 1,003 nvoda = 1,333 nglycerol = 1,473 ncedrový olej = 1,515 nbromnaftalen = 1,658 nmetyleniodid = 1,740 • NA maximální hodnota je kolem 1,5 Fyzikální principy mikroskopie Použití imerzního prostředí Levý paprsek opouštějící sklíčko se láme na jeho rozhraní se vzduchem od kolmice a nemůže se podílet na tvorbě obrazu. Pravý paprsek prochází do imersního prostředí (jež má index lomu podobný jako sklo mezi 1,5 -1,9), nemění svůj směr a podílí se na tvorbě obrazu. Fyzikální principy mikroskopie Další specifikace objektivů Tloušťka krycího sklíčka (standardně 0,17 mm). Některé objektivy mají korekční kroužek pro kompenzaci odchylek od tohoto standardu. Pracovní vzdálenost – Vzdálenost mezi čelem čočky objektivu a krycím sklíčkem, je-li pozorovaný předmět v ohnisku. Zmenšuje se při rostoucím zvětšení. Novější objektivy mají na sobě údaj o pracovní vzdálenosti v mm. Barevné kódy – Výrobci mikroskopů označují svoje objektivy barevnými kódy, aby se usnadnila identifikace zvětšení a požadavků na imersní prostředí. Fyzikální principy mikroskopie Mez prostorové rozlišovací schopnosti mikroskopu Mezní rozlišovací schopnost je úměrná numerické apertuře NA a nepřímo úměrná vlnové délce  použitého světla (německý fyzik Abbe,1840-1905). V některých učebnicích je uváděn výraz pro rozlišovací schopnost:  = /NA, kde  je vzdálenost dvou ještě rozlišitelných bodů (NA = n·sin, kde n je index lomu prostředí mezi objektivem a krycím sklíčkem a  je dříve zmiňovaný zorný úhel). Prostorové rozlišení roste se zvětšením. Kombinací silných spojných čoček bychom mohli sestrojit mikroskop s téměř libovolným zvětšením, avšak místo toho zjišťujeme, že za určitou hranicí (hranice „užitečného zvětšení“) se rozlišení již nezvětšuje (jde o „prázdné“ zvětšení). Jestliže se zmenšuje apertura (otvor) kondenzoru, prostorové rozlišení se snižuje, avšak roste kontrast! Proto musíme při volbě apertury kondenzoru dbát o vyváženost prostorového rozlišení a kontrastu. Chceme-li jen snížit jas obrazu, je vhodnější ztlumit lampu než zmenšit aperturu kondenzoru, protože takto nedojde ke zhoršení rozlišovací schopnosti. Fyzikální principy mikroskopie Hloubka ostrosti Z Jde o tloušťku objektu podél osy z, která se současně nachází v ohnisku. Důležité u silnějších vzorků. n je index lomu vzorku (resp. tekutiny obklopující mikroskopovaný objekt). Varianty optické mikroskopie Pozorování ve světlém nebo tmavém poli Stereomikroskop (dva mikroskopy se samostatnými objektivy a okuláry, jejichž optické osy svírají úhel asi 15°) – stereoskopické vidění. V medicíně: mikrochirurgie. Obraz nesmí být převrácený. Operační pole je osvětleno optickými vlákny. Ohnisková vzdálenost objektivu se může plynule měnit - zoom – různé prostorové rozlišení. mikrofotografie nebo mikrokinematografie (video). Software pro zpracování obrazu: mění kontrast, jas, ostrost atd. Pokročilý software umožňuje kvantitativní analýzu obrazu, hledání typických tvarů atd. Většina druhů mikroskopů může být sestavena z různých objektivů, okulárů, kondenzorů a dodatečně vybavena různými speciálními optickými prvky. Je k dispozici různé příslušenství, např. mikromanipulátory pro umísťování elektrod do buněk, separování organel atd. Varianty optických mikroskopů Stereomikroskop •The OPMI® Vario/NC 33 surgical microscope Varianty optických mikroskopů Mikroskop s fázovým kontrastem Tato technika vytváří kontrastní obrazy např. živých buněk, jejichž struktury mají podobný útlum (jsou rovnoměrně průsvitné a proto málo kontrastní v mikroskopu zobrazujícím rozdíly v amplitudě procházejícího světla), avšak lehce se liší svým indexem lomu (v důsledku čehož dochází k fázovým posunům – rozlišení tzv. fázových objektů). Fázově kontrastní technika mění rozdíly ve fázi v rozdíly v amplitudě. Živé buňky mohou být zkoumány ve svém přirozeném stavu, tj. bez fixace a barvení. Varianty optických mikroskopů Mikroskop s fázovým kontrastem Do přední ohniskové roviny kondenzoru je přidána clona se štěrbinou ve tvaru mezikruží, kterou pak prochází světlo. Když světlo prochází vzorkem, paprsky jsou odchylovány z původního směru a současně různě zpožďovány průchodem různými tloušťkami materiálu objektu. V obrazové ohniskové rovině objektivu se nachází fázová destička, opět ve tvaru mezikruží, jež posunuje fázi o +/2 nebo -/2), tj. o čtvrtinu vlnové délky. Tato destička propouští paprsky, které nezměnily svůj směr na fázových objektech. Ostatní paprsky destičku minou a jejich fáze se nezmění. Obraz se vytváří interferencí fázově posunutých a neposunutých paprsků. Fázové objekty pak vypadají jako tmavé nebo světlé vůči svému okolí (pozitivní nebo negativní kontrast). Podle http://www.nobel.se/physics/educational/microscopes/phase/ Varianty optických mikroskopů Mikroskop s fázovým kontrastem http://micro.magnet.fsu.edu/ http://micro.magnet.fsu.edu/ Varianty optických mikroskopů Mikroskop s fázovým kontrastem Améba ve fázovém kontrastu, Z = 250x (www.durr.demon.co.uk/ colour.html.) Mnohé bezbarvé biologické objekty (obtížně pozorovatelné v běžném mikroskopu) jsou fázovými objekty. Barviva je mohou zviditelnit, jsou však často pro buňky jedovatá. Fázově kontrastní mikroskopy umožňují pozorovat takovéto objekty bez barvení. Varianty optických mikroskopů Fluorescenční mikroskop Fluorescenční mikroskopie je založena na schopnosti některých látek emitovat viditelné světlo po ozáření světlem o kratší vlnové délce (UV záření nebo fialové světlo). Optika kondenzoru musí být přizpůsobena UV záření (křemenné, kazivcové sklo), které však může k preparátu přicházet též objektivem (horní osvětlení). Zbývající části mikroskopu jsou stejné jako u běžných mikroskopů. Nutná je ochrana očí před UV zářením (UV filtry). Fluorescenci vykazuje např. tryptofan či jiné sloučeniny s aromatickým kruhem či heterocyklem. Ve většině případů se však ke vzorkům přidávají fluorescenční barviva specificky interagující s různými buněčnými strukturami. Často je barvivo (fluorochrom, fluorescenční sonda) vázáno na (monoklonální) protilátku specifickou pro některou bílkovinu. Tato imunofluorescenční metoda může selektivně zviditelnit např. cytoskelet, chromatin či různé membránové bílkoviny. FM [USEMAP] Varianty optických mikroskopů Fluorescenční mikroskop Aktinová vlákna kvasinek zviditelněná fluorescenční mikroskopií – barveno rhodaminem-phalloidinem www.paulgyoung.com/.../ fission_yeast_actin_cytoskeleton.htm. Viriony v infikované buňce - http://usa.hamamatsu.com/sys-biomedical/slcn2400/slcn-smpl.htm Cytoskelet zviditelněný imunofluorescenční metodou Mikrotubuly HeLa buněk Mikrofilamenta HeLa buněk Varianty optických mikroskopů Fluorescenční mikroskop Speciální optické mikroskopy Konfokální laserový skenovací mikroskop L - laser, C – clony s malými kruhovými otvory, PPZ – polopropustné zrcadlo, DET – detektor světla (fotonásobič), SM – skenovací mechanismus, Č – čočka objektivu (projektivu), O – bodový předmět, PREP – preparát (řez). Pouze paprsky odražené od bodových struktur v ohnisku mohou projít přes clonu C před detektorem. Ostatní paprsky (rozptýlené) jsou zastaveny clonou. Tyto paprsky by u běžného mikroskopu zhoršovaly kvalitu obrazu, protože snižují kontrast. Pomocí tohoto mikroskopu můžeme zkoumat poměrně silné nativní řezy. Skenovací mechanismus je systém rotujících zrcadel, která mohou s ohniskem pohybovat v hustých rovnoběžných liniích. Konfokální laserový skenovací mikroskop 3D obraz neuronu, fluorescence - http://www.cs.ubc.ca/nest/magic/neuron.html V praxi se používá imunoznačení pro specifikaci pozorovaných struktur, zvýraznění chromozomů, membránových receptorů. Konfokální laserový skenovací mikroskop Souběžné použití absorpčního spektrofotometru jako součásti konfokálního mikroskopu, náhrada běžného laseru za „bílý laser“, tj. laser s plynule laditelnými vlnovými délkami 470-670 nm, určený k spektrofotometrickým analýzám - např. určení koncentrace léčiva ve sledovaném vzorku během kultivace. Live Cell Imaging- sledování růstu buněčných kultur v reálném čase v průtokové komůrce Sledování přímých účinků chemických nebo fyzikálních faktorů na buněčné kultury. • Superrozlišení – prolomení difrakční bariéry Skenovací mikroskopie v blízkém optickém poli (near field optical scanning microscopy - NFOSM) NFOSM = NSOM = SNOM Schéma mikroskopu pro pozorování v blízkém optickém poli. Úzký svazek světla argonového laseru prochází velmi malým otvorem (ø řádově desítky nm) v kovem pokrytém (hliník) skleněném hrotu. Tenký řez se pohybuje nad otvorem v konstantní vzdálenosti. Obrázek vlevo dle Rontó a Tarjána (1994). Využívány vlastnosti tzv. evanescentní světelné vlny. [USEMAP] Světlo procházející osvětlovacím hrotem přístroje pro skenovací mikroskopii v blízkém optickém poli pozorované v normálním optickém mikroskopu http://physics.nist.gov/Divisions/Div844/facilities/nsom/nsom.html Plasmidová DNA (10 kb) •http://www.snom.omicron.de/examples/twinsnom/x-tsnom_12.html Superrozlišení – prolomení difrakční bariéry: Skenovací mikroskopie v blízkém optickém poli Superrozlišení – prolomení difrakční bariéry Stimulated Emission Depletion – STED Analogie konfokálního mikroskopu, která využívá zhášení fluorescence ke zlepšení rozlišovací schopnosti – dochází k překonání tzv. difrakčního limitu. Mikroskop založený na principu fluorescence v kombinaci s jejím potlačením. Klasický fluorescenční mikroskop je omezen difrakcí. Pokud ale pro vybuzení fluorescence použijeme laser, jehož svazek má tvar mezikruží - uvnitř zastíněný - a má nižší energii (delší vlnovou délku) než světlo, které by vyvolalo fluorescenci, dojde v místě kam svazek dopadá k potlačení fluorescence. Vnitřní oblast mezikruží na vzorku je vystavené laseru s vyšší energii (kratší vlnovou délkou), která fluorescenci vyvolá. Ta je zaznamenávána - skenovacím způsobem. Rozlišení takového mikroskopu je pak dané velikostí vnitřního otvoru "koblihy" (z anglického "donut"), dnes kolem 50 nm i méně. Synaptické vezikuly Superrozlišení – prolomení difrakční bariéry Stimulated Emission Depletion – STED Elektronová mikroskopie „Klasické“ elektronové mikroskopy (EM) používají pro zobrazení svazky urychlených elektronů. Elektrony mají vlnovou délku tzv. de Broglieových hmotnostních vln. Připomeňme si následující vztahy:  je vlnová délka, h Planckova konstanta, m relativistická hmotnost elektronu, v jeho rychlost, e – jeho elektrický náboj a U je urychlovací napětí. Je-li velikost pozorovaných objektů srovnatelná s , dochází k difrakci a vytvoření obrazu je znemožněno. Elektron s energií 1,5 eV má vlnovou délku 1 nm. Pomocí urychlených elektronů dosahujeme zhruba 105-krát kratších . Viz  = /nsin. Velké optické vady systému však způsobují, že numerická apertura je velmi malá - řádově 10-2. Prostorové rozlišení EM je v praxi na úrovni několika desetin nm. Elektronová mikroskopie Magnetická čočka Příčný řez cívkou, která je magneticky stíněna pancéřováním. Elektronový svazek je fokusován v místě, kde je pancéřování přerušeno. Magnetická čočka působí na elektrony jako spojka na světlo. transmisní elektronový mikroskop (TEM) www.mauricewilkinscentre.org/bioviz/ anoda žhavená katoda Vysoké napětí Rotační vývěva stínítko clona vzorek clony okno na sledování vzorků Okulár na prohlížení detailů Kazeta s filmem Olověné stínění Transmisní elektronový mikroskop Brookhaven TEM Zvětšení 50 000 000x, rozlišení 0,1 nm, Lze provádět simultánně chemickou analýzu vzorku pomocí rentgenové spektrometrie (pouze některé prvky). Transmisní elektronový mikroskop Rozdíl mezi řezem a replikou Buňky HL-60, fragment jádra, morfologické změny v průběhu apoptózy. Levý snímek- ultratenký řez, kontrastování OsO4. Pravý snímek- replika lomu, napařená vrstva Pt a C. Snímky z TEM MORGAGNI 268 D (Philips), snímané na CCD kameru. http://www.ualberta.ca/~mingchen/tem.htm Buňky břišního svalu  Coronavirus, negativní barvení (ne covid-19!)  Transmisní elektronový mikroskop Plasmatická membrána Buňky HL-60, metoda freeze-etching TEM Jaderná membrána Transmisní elektronový mikroskop Různé organely Skenovací elektronová mikroskopie tescan mikroskop 2500 Skenovací elektronová mikroskopie - SEM Podle: http://www.rpi.edu/dept/materials/COURSES/NANO/shaw/BigSEM.gif Podobně jako u metody TEM, jsou i pro SEM vzorky připravovány velmi složitým způsobem – zde musí být pokryty tenkou kovovou vrstvou pro zajištění vodivosti povrchu. Detail nohy mravence v SEM http://www.wtn.org/ss/story.phtml?storyId=33&type=EdOutreach Vajíčka ježovky obklopená spermiemi, SEM 3000x zvětšeno http://www.stanford.edu/dept/news/report/news/august9/sperm-89.html Skenovací elektronová mikroskopie Mikroskopie skenující sondou Skenovací tunelový mikroskop (STM) Schéma skenovacího tunelového elektronového mikroskopu (STM). Dole detail kovové detekční jehly. Kladně nabitá jehla kopíruje povrch vzorku. Podle Rontó a Tarjána (1994). Nápis IBM vytvořený z atomů xenonu na niklové podložce http://www.almaden.ibm.com/vis/stm/images/stm10.jpg Rozštěpené a nenarušené kruhy plazmidové DNA •http://www.sci.port.ac.uk/spm/overfig5.htm Skenovací tunelový mikroskop STM – Simulace povrchu křemíku s navázaným benzenem. Tato struktura bude následně porovnána se strukturou zjištěnou experimentálně. Skenovací tunelový mikroskop Moderní mikroskopy STM (a AFM) umožňují ověřování struktury složitých molekul či krystalů, což má zásadní význam pro vývoj počítačových komponent (paměti a procesory na úrovni nanotechnologií). Je zde vidět, že "adatoms" leží jakoby nad rovinnou plochou krystalu, "restatoms" jsou níže - dáno trojrozměrným tvarem krystalů. Interakce benzenu, vzhledem k jeho velikosti, s jedním ad- a jedním restatomem. Proto "neleží rovně" na povrchu. Jde o projev van der Waalsových sil. STM - Experimentální data s naznačenou polohou atomů křemíku a molekuly benzenu Mikroskopie atomárních sil (AFM) AFM – Atomic force microscopy – hrot sleduje profil povrchu vzorku. •http://physchem.ox.ac.uk/~rgc/research/afm/afm1.htm Mikroskopie atomárních sil Dle O. Krejčího Mikroskopie atomárních sil DNA – linearizovaná plasmidová •http://www.snom.omicron.de/examples/twinsnom/x-tsnom_12.html Povrch křemíku – atomární rozlišení včetně molekul benzenu Dle O. Krejčího Strukturní studie s využitím STM a AFM Mikroskopy založené na jiných fyzikálních principech Akustická mikroskopie Akustický sken čipu s vnitřním poškozením http://www.predictiveimage.fr/en/applications/78/analyse-de-defaillance-pont-de-diodes-defectueux-m icroscopie-acoustique/ •podle: http://www.sv.vt.edu/comp_sim/sam/full.gif Odrazová varianta http://www.predictiveimage.fr/public/media/images/applications/analyse_de_defaillance-pont_de_diode s-microscopie_acoustique/SAM-Gate3-AbsPeak.png Autoři: Vojtěch Mornstein Daniel Vlk Naděžda Vaškovicová Poslední revize a ozvučení: duben 2021