Metody molekulární biologie DNA diagnostika Mgr. Katarína Chalásová, PhD. Ústav patologické fyziologie, LF MU 1. Opakování pojmů z molekulární biologie 2. Genetická DNA diagnostika 3. Základní metody molekulární biologie 4. Praktická ukázka a vlastní provedení PCR* Osnova Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • nukleové kyseliny, rozdíl mezi RNA a DNA, • primární stavba DNA a RNA, dusíkaté báze, nukleotid, nukleosid • sekundární stavba DNA a RNA, dvojzávitnice, párování bází • replikace DNA – kde, kdy, enzymy, vedoucí a opožďující se řetězec • transkripce – kde, typy RNA, enzymy, posttranskripční modifikace • translace – kde, ribozomy, endoplazmatické retikulum, genetický kód, kodony vs antikodony, posttranslační modifikace • centrální dogma molekulární biologie • mutace vs polymorfismus 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • sekundární stavba DNA a RNA, dvojzávitnice, párování bází 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • replikace DNA – kde, kdy, enzymy, vedoucí a opožďující se řetězec • transkripce – kde, typy RNA, enzymy, posttranskripční modifikace 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • translace – kde, ribozomy, endoplazmatické retikulum, genetický kód, kodony vs antikodony, posttranslační modifikace 1. Opakování pojmů z molekulární biologie Co byste již měli znát a jenom si zopakovat: • centrální dogma molekulární biologie • mutace vs polymorfismus 1. Opakování pojmů z molekulární biologie 2. Genetická diagnostika • upřesnění diagnózy • výběr správné léčby • predikce rizika do budoucnosti  specializovaná péče • zaměření na konkrétní mutaci 2. Genetická diagnostika • cílí na konkrétní mutace v genu nebo chromozomu a) postnatální diagnostika o upřesnění diagnózy, výběr správné léčby, predikce rizika o častější návštěvy lékaře, cílené vyšetření, změna životního stylu… b) prenatální diagnostika o stanovení rizika nemoci u plodu/embrya o výhoda připravenosti c) preimplantační diagnostika 2. Genetická diagnostika • výsledky genetického vyšetření můžou být k dispozici za několik hodin, nebo třeba i měsíců • vliv na to má: a) složitost použité metodiky b) nutnost kultivace buněk (může trvat i týden) c) pracoviště v místě odběru / specializovaná laboratoř v rámci ČR d) kvalita DNA e) celý gen, nebo více genů vs. laboratoř přesně ví, jakou mutaci hledá  Cytogenetické vyšetření o vyšetřuje chromozomální aberace = odchylky na úrovni chromozomů o stanovuje se karyotyp, počet a struktura chromozomů o vzorky krve, kožní fibroblasty, nebo materiál získaný prenatálně invazivním způsobem → buňky se kultivují → BC zastaven v konkrétní fázi → ošetřeny barvivem/sondou → mikroskopicky vyhodnocovány 2. Genetická diagnostika  Molekulární genetika o identifikuje patologické změny DNA na molekulární úrovni o vyšetřována nemoc způsobená mutací v genu o izolace lidské genomové DNA z krve, tkání, nebo buněk po kultivaci → pomnožení konkrétního úseku (PCR) → hodnocení různými molekulárními technikami. 2. Genetická diagnostika G-pruhování = Giemsovo barvení • nejčastěji rutinně užívaná metoda • chromosomy vystaveny účinkům trypsinu a obarveny Giemsovým barvivem • každý chromosom se specificky obarví * některé cytogenetické metody Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) • fluorescenční obarvení části chromozomu pomocí komplementární sondy * některé cytogenetické metody Spektrální karyotypování (SKY) • identifikace každého chromosomu pomocí jedinečné kombinace 5 fluorochromů * některé cytogenetické metody • polymerázová řetězová reakce (PCR) • polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) mutace v genu XY záměna G za A 3. Metody molekulární biologie G G A G A A • polymerázová řetězová reakce (PCR) • polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) 3. Metody molekulární biologie • voda + pufr • templátová / testovaná DNA • primery • nukleotidy • enzym DNA polymeráza • Mg2+ • polymerázová řetězová reakce (PCR) • polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) mutace v genu XY záměna G za A 3. Metody molekulární biologie G G A G A A X X PCR produkt = 822 bp X • polymerázová řetězová reakce (PCR) • polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) 3. Metody molekulární biologie Bsm I 5‘ … CTTACG|N… 3‘ CTTACG CTTACG 646 bp 176 bp CTTACA CTTACA 822 bp CTTACG CTTACA 646 bp 176 bp 822 bp • polymerázová řetězová reakce (PCR) • polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) • gelová elektroforéza (agarózový gel / polyakrylamidový gél) 3. Metody molekulární biologie Pacient 1 AA Pacient 2 GG Pacient 3 AG 176 bp 646 bp 822 bp • polymerázová řetězová reakce (PCR) • polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) • gelová elektroforéza (agarózový gel / polyakrylamidový gél) 3. Metody molekulární biologie Pacient 1 AA Pacient 2 GG Pacient 3 AG 176 bp 646 bp 822 bp • polymerázová řetězová reakce (PCR) • polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) • gelová elektroforéza • PCR v reálním čase (RT-PCR) 3. Metody molekulární biologie • analýza proteinové exprese imunohistochemicky • analýza genové exprese T-PCR 3. Další metody molekulární biologie • Intenzivní cvičení – tvorba ROS – potřeba antioxidačních mechanismů • HSP70 a HSF1 – součást antioxidační glukosaminové dráhy (GSH) • GSH syntetizován z L-glutaminu – intenzivní cvičení snižuje L-glutamin ? Ovlivní suplementace ALA+GLN proteinovou expresi HSP70 a HSF1 u potkanů? „suplementace alaninem a glutaminem chrání buňku před oxidačním stresem během cvičení“ É.R. Petry et al., Life Science 94 (2014) 130-136 Příklad Analýza proteinové exprese • struktura DNA neměnná • exprese proteinů (a aktivita enzymů) se mění v závislosti od vnitřních a vnějších podmínek • míru exprese (aktuální množství proteinu) můžeme sledovat pomocí vazby protilátka+antigen o čím víc proteinu ve vzorku – tím víc navázané protilátky – tím silnější signál - 24 potkanů - 8 týdnů - cvičení 5 dnů / týden na 60 min ctrl bez GLN + GLN Příklad Analýza proteinové exprese • izolace proteinů z biologického materiálu (sval Soleus Muscle) • rozdělení fragmentů (proteinů) na akrylamidovém gelu Příklad Analýza proteinové exprese protein HSF substrát anti-rabbit + enzyme anti-HSF (p. in rabbit) • izolace proteinů z biologického materiálu (sval Soleus Muscle) • rozdělení fragmentů (proteinů) na akrylamidovém gelu • přeblotování proteinů z gelu na membránu (ireverzibilně) • inkubace s protilátkami • vizualizace signálu Příklad Analýza proteinové exprese • Diabetes – oxidační stres – potřeba antioxidační ochrany buňky • Vitamin D - ne jen Ca a P homeostázu – má i mnoho jiných efektů (DM) ? Má vit D vliv na genovou expresi enzymů, které by mohli buňky chránit před oxidačním stresem? „vitamin D zvyšuje genovou expresi antioxidačních enzymů in vitro jak v normo- tak v hyperglykemických podmínkách“ K. Chalásová et al., Food Function 7 (2016) 2537-2543 Příklad Analýza genové exprese • struktura DNA neměnná • exprese genů (a aktivita enzymů) se mění v závislosti od vnitřních a vnějších podmínek • míru exprese (aktuální množství mRNA) můžeme sledovat pomocí metody realtime PCR o V reálním čase sledujeme exponenciální navyšování produktu a porovnání mezi sebou můžeme usoudit původní relativní množství Příklad Analýza genové exprese • Izolace total RNA – měření koncentrace • Přepis – reverzní transkripce enzymem Rev transkriptáza Příklad Analýza genové exprese • Izolace total RNA – měření koncentrace • Přepis – reverzní transkripce enzymem Rev transkriptáza • RT-PCR – syntéza cDNA a sledování v reálním čase • Vyhodnocení relativního množství metodou ΔΔct Příklad Analýza genové exprese • čipové metody, microarrays • sekvenování DNA 3. „Nové“ metody molekulární biologie • čipové metody, microarrays 3. „Nové“ metody molekulární biologie • sekvenování DNA i. chemická metoda = Gilbertovo s. o podstatou je specifické štěpení DNA v místech, kde je lokalizovaná báze určitého typu 3. „Nové“ metody molekulární biologie • sekvenování DNA i. chemická metoda = Gilbertovo s. o podstatou je specifické štěpení DNA v místech, kde je lokalizovaná báze určitého typu ii. enzymová metoda = Sangerovo s. o „čtená“ DNA použita jako matrice pro PCR o PCR začíná od značeného primeru o PCR končí u terminatoru = ddNTP = dideoxyribonukeotid-fosfát = konec, chybí –OH skupina o změs ddNTP a dNTP = různě dlouhé amplikony 3. „Nové“ metody molekulární biologie • sekvenování DNA i. chemická metoda = Gilbertovo s. o podstatou je specifické štěpení DNA v místech, kde je lokalizovaná báze určitého typu ii. enzymová metoda = Sangerovo s. o „čtená“ DNA použita jako matrice pro PCR o PCR začíná od značeného primeru o PCR končí u terminatoru = ddNTP = dideoxyribonukeotid-fosfát = konec, chybí –OH skupina o změs ddNTP a dNTP = různě dlouhé amplikony iii. automatické sekvenování o nukleotidy specificky značené fluorescenčně 3. „Nové“ metody molekulární biologie Mgr. Katarína Chalásová, PhD. Ústav patologické fyziologie, LF MU