Andrologie Soňa Kloudová sona.kloudova@med.muni.cz 18.4.2023 Historie • 1776- Lazaro Spallanzani - pokus o uchování spermatu ve sněhu • 1949 - Ernst John Christopher Polge - kryoportektivní vlastnosti glycerolu • 1951 - první potomek z kryokonzervovaného ejakulátu -skot • 1953 - první dítě z kryokonzervovaného ejakulátu (suchý led) • 70. léta 20. století-vznik lidské kryobanky • Rozvoj inseminací u zvířat • Důležitý pokrok v oblasti technik asistované reprodukce u lidí Využití kryokonzervovaných spermií • U zvířat- inseminace - „genetické zlepšení" • Metoda k řízení a uchování plodnosti -medicínské důvody-chirurgická léčba, chemoterapie, rádioterapie, hormonálni terapie -před pubertou - odběr tkáně z varlete, kryokonzervace spermatogoniálních kmenových buněk nebo testikulární tkáně - transgender osoby - social freezing -např. nebezpečné povolání, Vasektomie • Léčba neplodnosti - nemožnost odběru v den OPU, komplikovaný odběr, těžké Oligozoospermie, vzorky (extrakce spermií z varlete-TESE nebo aspirace spermií z nadvarlete -MESA), dárcovství spermií -využití pro IUI, IVF, ICSI Patient Condition Sperm Collection Method What Makes Them Eligible for Sperm Banking? Adult cancer Frequent ejaculation Frequent ejaculation (when they are Cancer and related therapies damage the gonads and impair spermatogenesis Adolescent cancer sexually mature), penile vibratory stimulation, and electroejaculation Same as above Cancer in prepubescent males Testicular tissue freezing Cancer treatment negatively affects spermatogenesis; testicular tissue extraction is a promising experimental procedure Preoperative surgical procedure (o trea: or Frequent ejaculation Bilateral varicocele ligation, prior to vasectomy induce infertility Non-malignant disease Frequent ejaculation Systemic stress may impair spermatogenesis; gonadotoxic therapies affect semen quality Exposure to harmful chemicals may decrease fertility or cause chromosomal Occupational risk Frequent ejaculation damage in the germ cells: facing hazardous situations that may result in an accident that causes infertility Posthumous sperm Electroejaculation surgical removal of testes Performed at the time of brain death based upon the patient's will or family cryopreservation and epididymides request Sex change/ gender Frequent ejaculation removal of testicular Hormone therapy damages spermatogenesis, and gender reassignment reassignment tissue surgery sterilizes the male Cryopreservation of Sperm: A Review Gururaj M. Borate 1 , Ajay Mťshram J Biologie kryokonzervace spermií • malá buňky s velkým povrchem -> vliv na viskozitu a teplotu skelného přechodu cytosolu - menší náchylnost k poškození • v nepřítomnosti kryoprotektiv-šok chladem + tvorba krystalů -> destrukce buněčných organel • Principem úspěchu je minimalizace tvorby krystalů • nutnost přídavku kryoprotektiv a látek stabilizujících membrány • kryotoleranci a chladovou toleranci ovlivňuje lipidové složení membrán - mezidruhové rozdíly (rozdíly v profilu mastných kyselin a v poměru omega3 /omega 6 mastných kyselin), rozdílná velikost i tvar spermií • Na přežití spermií po kryokonzervaci má vliv také funkční kvalita spermií před zamrazením - asthenozoospermiecké vzorky jsou náchylnější k poškození mrazem, dochází ke snížení fertilizační schopnosti Ultrastrukturální změny během kryokonzervace Rozpad akrozomu, částečné odnětí vnější akrozomální membrány- důsledek tvorby krystalů extracelulárních roztoků osmotické změny vedoucí k poškození lipidových membrán (změny napětí v membránových kanálech, úniky iontů)-> morfologické změny Poškození proteinů cytoskeletu (např. aktin, vimentin) - zvrásnení cytoplasmy, bobtnání subakrosomální oblasti, ztráta obsahu akrosomu, vesikulovitý vzhled, zvýšený podíl volných hlaviček a defektů bičíku Poškození mitochondrií a jejich funkcí Oxidační stres rychlejší mrazení redukuje ultrastrukturální změny a chrání integritu spermií v porovnání s pomalým mrazením Nejlepší ochranné vlastnosti pro spermie má glycerol glycerol v kombinaci s vaječným žloutkem nejlépe chrání apikální část akrozom a mitochondrie během kryokonzervace dochází k ovlivnění exprese genů a proteinů, stability mRNA a k určitým změnám na epigenetické úrovni (metylace DNA) Změny v expresi klíčových genů vztahujících se k plodnosti - u kance dochází po kryokonzervaci ke změně v expresi 41 genu změny v expresi AKAP3, SOD 1 nebo HSP90 (hraje roli v motilitě) změny v proteinech vztahujících se k motilitě, vitalitě a integritě akrozómu (mitochondriální akonitát hydratáza, tektin 1, alfa-enoláza, vimentin), změny v hladině fosforylace tyrosinu, změna v proteinech ovlivňujícíh metabolismus spermií nebo strukturu bičíkupo kryokonzervaci dochází ke snížení motility, funkčnosti plasmatické membrány, integrity akrozómu, viability Mechanismy nejsou zcela objasněny Změna osmolarity, intracelulární tvorba krystalů zvýšená produkce ROS a snížená antioxidační kapacita enzymů-> oxidace DNA -> zlomy do kryokonzervačních médií se často přidávají antioxidanty korelace mezi snížením motility a defekty mitochondrií po rozmražení Molecular alterations DNA fragmentation Degradation of mRNA ,-ffinniniiniiiii ii i n 111IHMIIHHHIIQ00 r Alterations in miRNA cargo TTTTTTTT Alterations in DNA methylation Changes in DNA/protamine complex Structural alterations Formation of ice crystals Exocytosis Acrosome damage Decreased metabolic activity Changes in motility and kinematic parameters Apoptotic-like changes https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432021002190 Table 1. Freezability markers identified in cattle, pig, sheep and horse sperm. Marker Sperm proteins proAKAP4 Heat shock protein 90AA1(HSP90AA1) Heat shock protein 8 (HSPA8) Aquaporin 7 (AQP7) Aquaporin 3 (AQP3) Voltage-depend ent anion channel 2 (VDAC2) Glutathione S-transferase Mu 3 (CSTIVB) SP proteins Fibroncctin-1 (FN1) 26 S proteasome and CCT complex Acid seminal fluid proteins (aSFP) Effects Could help predict factors underlying cryogenic damage, such as oxidative stress Species Reference Horse Pijj Sheep Maintain metabolic and structural integrity Cattle of cells under stress conditions Involved in the permeability of the plasma membrane to water and permeable cryoprotectants Allows the transport of ions Involved in cellular protection against oxidative stress Could help predict factors underlying cryogenic damage, such as oxidative stress Pis Cattle Pis Pis P'S Pis [Blommaert et al., 2019) [Perej-Patino et al., 2019a) [Riesco etal., 2020) [Zhang et .il., 2015) [Casasetal., 2010] Cattle [Holt et al., 2015) [Prieto-Martinez et al,, 2017b) [Prieto-Martinez et al,, 2017a) [Vilagran et al., 2014] [Llavanera et al,, 2019) [Vilagran et al., 2015] Sheep [Rickand et a],, 2015) Cattle [E inspanier et al., 1994) https://www.sciencedirect.com/science /article/pii/S0378432021002190 Proces kryokonzervace • Kryoprotektanty permeabilní: Glycerol, DMSO -průnik do buňky, zábrana tvroby krystalů • Kryoprotektanty nepermeabilní: albuminy, dextrany, vaječný žloutek (lipoproteiny) -ochrana membrány na povrchu buňky • Prepubescentní odběr tkáně z varlete- DMSO a sucrosa • Lidské spermie jsou relativně tolerantní k teplotnímu šoku (rychlé ochlazení/oteplení) -pravděpodobně díky vysoké fluiditě membrán (nízký podíl nenasycených vs nasycených mastných kyseliny), nízkému obsahu vody (50%) • Přesto pokles motility spermií o 30- 50 % • Cooling rate- klíčový parametr, rychlost ochlazení (i zahřívání-warming rate) musí být kontrolována • Klasická kryokonzervace - delší mrazící procedura, vyšší objemy dávky • Vitrifikace - rychlejší procedura -vysoký rychlost chlazení, malé objemy spermií, přímý kontakt s tekutým dusíkem (riziko kroskontaminace) • Na počátku byla kryokonzevační média připravována přímo v laboratoři • Dnes komerčně dostupná s vhodnou certifikací • Metoda mrazení podle doporučení výrobce (ejakulát nebo promytá susmenze spermií se s mísí v určitém poměru s mrazícím médiem, umístí se do nosiče a zamrazí) • Často se využívá umístění dávek do par tekutého dusíku, mnohdy v kombinaci s preekvilibrací v chladničce • Nutnost kvalitního značení dávek!!!! • Nutnost dobré kontroly-dvojitá kontrola nebo matcher systém • Dokumentace: souhlas se zamrazením a souhlas s případnou likvidací! L5 L5 I 8 ■iio-.»i- SpermFreeze Solution '.y., ty. si «in« B--1""'" SŕCfmFreen SwmFŕMF SwmFretK ScO'mFrw ScMio«r Solution'* Solution* SoWion'" Frwrnj Midlum VltroUft T 35 (íľN In-VüroF ertiidion. Inc. (30 Tnini)u(l,čT"066li USA [Juinrľs Advantage™ SjjJ ^'ams Gentamicin andlOmr ľ .t Šíj '5252503 Ž »15.0ec • Složení kryokonzervačních média: glycerol, TRIS, cukry (fruktóza, sukróza, threalóza), vaječný žloutek, antibiotika (gentamicin), antioxidanty (vit C a E, glutathion, SOD, kataláza...) • Mrazící protokoly: rychlé mrazení v parách dusíku (-167°C) -nejčastější vitrifikace (přímo do tekutého dusíku: -196°C)-zřídka manuální pomalé mrazení programované pomalé mrazení-skoro se již nepoužívá • Příklady způsobu rozmrazení: rychlé při 37°C 5 minut v pokojové teplotě a následné ponoření do 37°C rychlé rozmrazení při 40°C rozmrazení při pokojové teplotě Pre-cryopfeservation selection of motile spermatozoa Post thawing sperm selection 1 improving strategies 1 Addition of ir 111. wi uvolnění do darovacího procesu • Genetické vyšetření - kary o typ, CFTR, SMA, GJB 2 • Výběr podle krevní skupiny a charakteristických rysů ti*: EUROPEAN SPERM-BANK 9tř. Kosmonautů 1338/la, Olomouc i SpermBank M I International https://eshop.myspermbank.cz/ Filtrovat podle: 1 00 \ Typ vlasů ▼ Barva vlasů ▼ Vzdělání - Krev - RH faktor - Astrologické znamení ▼ >- Použití - Výška - Aken Alex Algiz Ares