Andrologie
Soňa Kloudová
sona.kloudova@med.muni.cz
21.3.2023
WHO 2010 vs. WHO 2021
• Statisticky silnější soubor vstupních dat
• Znovu se rozlišuje rychlá a pomalá progresivní
pohyblivost spermií (systém a,b,c,d)
• Hodnotí se zápach ejakulátu
• Chybí referenční hodnoty, nepoužívá závěrečné
slovní označení pro výsledky vyšetření
• Páté percentily sledovaných parametrů jsou
nedostatečné pro přesnou diagnózu mužské
neplodnosti
Vyšetření ejakulátu - spermiogram
• Posouzení plodnosti muže
• Posouzení kvality vzorku v průběhu času – například při léčbě (medikamentózní
nebo chirurgická), při změně životního stylu…
• Kontrola po vasektomii
• Výběr metody oplození
Stanovuje se: objem, zbarvení, zkapalnění, viskozita, pH, přítomnost ostatních
buněčných elementů (kulaté buňky, bakterie, erytrocyty, buněčné úlomky),
agregace a aglutinace spermií, koncentrace buněk, cekový počet spermií, motilita
spermií , morfologie spermií
Bezpečnost práce
Ejakulát je biologický potenciálně infekční materiál →
používat ochranné pomůcky: ochranný oděv, jednorázové
rukavice, případně rouška
-likvidace jako biologický infekční odpad
-pravidelná desinfekce pracovního místa i pomůcek
Odběr ejakulátu
• Odběr ejakulátu se provádí po 2-7 denní pohlavní abstinenci
masturbací, pouze do speciální nádobky vydané laboratoří
• Pokud není vzorek odebrán v místě vyšetření, je třeba jej doručit
nejdéle do hodiny po odběru, při transportu by teplota vzorku
neměla klesnout pod 20 °C
• Z hlediska interpretace výsledků je důležité vést informace o místě
odběru, délce pohlavní abstinence, času odběru a přijetí do
laboratoře, nemocech za poslední 3 měsíce a o užívaných lécích
• K vyšetření přijímáme pouze řádně označený vzorek
Vyšetření ejakulátu
• Vyšetření začínáme 30 minut po odběru vzorku, v případě poruchy
zkapalnění nebo viskozity vložíme vzorek na dalších 30 minut zpět do
inkubátoru a analýzu začneme 60 minut po odběru vzorku
• Pro vyšetření používáme aseptické netoxické materiály – tam kde je to
vhodné, lze provést „sperm toxicity“ test
• Provedeme základní analýzu: makroskopické a mikroskopické vyšetření
• Základní mikroskopické vyšetření spermií: motilita, koncentrace, vitalita,
morfologie
• O vyšetření vedeme bezprostředně záznamy v protokolu (včetně
primárních dat)
Základní vyšetření ejakulátu
• Vzhed ejakulátu
zabarvení ejakulátu – alarmující jsou barvy do zelena (zánět?) a do hněda (krev v
ejakulátu), sleduje se přítomnost vláken a želatinových inkluzí
Normání vzhled – homogenní, opaleskující krémově šedý
zkapalnění – mělo by proběhnout do jedné hodiny po odběru, ejakulát by měl mít
stejnou konzistenci, nezkapalněný vzorek působí nekonzistentním rozsolovitým dojmem
(stav ihned po odběru), nepřelévá se v nádobce souvisle, nezaměňovat s viskozitou!!
viskozita – vypouštění z pasteurovy pipety vzorek neodkapává souvisle, ale tvoří
„vlákna“ delší než 2 cm
Zápach – zaznamenává se netypický zápach (např. močový)
Vysoká viskozita – jak si poradit?
• Pokud je možné i přes vyšší viskozitu vzorek homogenizovat Pasteurovou pipetou
a pokud nečiní problém dostat vzorek z pipety, preferujeme provést vyšetření
bez úpravy
• V extrémním případě lze použít naředění vzorku 1:1 médiem pro spermie, nebo
fyziologickým roztokem (pozor na přepočet u koncentrace), ředění ovlivňuje
motilitu
• Opakované protažení ejakulátu injekční stříkačkou s jehlou o velkosti 18 nebo 19 –
dochází k poškození membrán a k ovlivnění motility
• Bromelain –proteolytický enzym – ovlivňuje pohyblivost a biochemické markery
• Stejné postupy lze použít i u těžkých případů poruch zkapalnění vzorku
Zhotovení vlhkého preparátu
• Pasterovou pipetou provedeme vyšetření zkapalnění a viskozity vzorku a zároveň
důkladnou homogenizaci vzorku (pozor, nenabublat ☺ )
• Kapku o objemu 10 µl umístíme na podložní sklo a překryjeme krycím sklem o velikosti
22x22 mm
• Počkáme až přestane „proudění“ v preparátu a začneme analýzu
• Zhodnotíme přítomnost kulatých buněk (v nenabarveném preparátu nemáme šanci
poznat typ buňky-leukocyt/vývojová buňka), erytrocytů, úlomků
• Zhodnotíme agregaci (vzájemné shlukování mrtvých spermií nebo shlukování spermií s
jinými elementy v ejakulátu) a aglutinaci spermií (shlukování živých spermií, možný
imunologický faktor)
Objem
• Samotné měření objemu jakýmkoliv způsobem je velmi nepřesné
• Doporučeno měřit pomocí vah
• 1g = 1ml
• Anomálie v objemu ejakulátu jsou způsobeny nesprávnou funkcí přídatných
pohlavních žláz
pH
• Měříme na začátku vyšetření (s časem pH roste)
• Doporučeno používat pH štítky –naneseme kapku pipetou
• vysoké pH je normální, nízké pH (pod 7,2)může být způsobeno
infekcí, přítomností moči a nebo sníženou funkcí semenných
váčků (50-80% ejakulátu, hustý zásaditý sekret)
Počet spermií
• Koncentrace spermií – zásadně stanovujeme na umrtveném vzorku!
-hodnotí se pomocí hemocytometrů nebo jiných komůrek
• Celkový počet spermií – důležitý ukazatel (objektivnější), ovlivněn
množstvím semenné plazmy
koncentrace spermií v mil / ml x objem v ml
-při odběru je důležité získat informaci o tom, zda je odebraný
vzorek kompletní, pokud ne, je celkový počet spermií zkreslený (první
frakce ejakulátu obsahuje nejvíce spermií)
Výpočet koncentrace spermií
• Dle WHO je doporučena Neubauerova komůrka
• každá mřížka je rozdělena do 9 hodnotících čtverců o ploše 1x1mm, výška 0,1mm
• Nutná imobilizace/fixace spermií
• Nutno odhadnout správné ředění
(odhadem dle počtu spermií
pod krycím sklem na ZP), nejčastěji
se ředí 1:20 nebo 1:5
• Počítá se minimálně 200 spermií v
každé mřížce
• Provádí se dvojí opakování
• Kvůli vysoké heterogenitě ejakulátu je vhodné připravit umrtvený vzorek z dostatečného
vstupního objemu ejakulátu, WHO doporučuje 50 µl
Výpočet koncentrace spermií
• Pro fixaci vzorku doporučuje WHO roztok s formalinem. Ten by však neměl být
používán v klinické praxi, proto pokud nemáme zvláštní prostory pro
andrologickou diagnostickou laboratoř, je lepší nahradit tento roztok teplou
vodou. Při tomto způsobu však občas vznikají potíže se shlukováním spermií a s
nerovnoměrným rozložením buněk v počítací komůrce.
• Lze využít i jiný typ hemocytometru s hloubkou 100 µm
(Burkerova komůrka, Thomova komůrka)
• Při finálním výpočtu koncentrace spermií je vždy třeba zohlednit ředící faktor ☺
Výpočet koncentrace spermií
• Velmi často je využívána Maklerova komůrka (hloubka
10µm) , pokud máme zajistit dostatečnou přesnost
měření, musí být koncentrace počítána vždy na
umrtveném vzorku !
• Hodnotíme – li koncentraci orientačně na neumrtveném
vzorku Maklerovou komůrkou, používá se vstupní
vzorek o nízkém objemu ejakulátu (5-10 µl), proto je
vhodné výpočet vícekrát zopakovat! (Ale vhodnější je to
takto nedělat a využít hemocytometr ☺)
Motilita spermií
• Stanovuje se po základní analýze ejakulátu (ještě před koncentrací a
morfologií), ihned po zkapalnění (po 30 nebo 60 minutách)
• Vzorek se umístí na běžné podložní sklo a překryje krycím sklem
• Podle nového manuálu WHO se hodnotí celkový podíl motilních spermií a dále
podíl rychle progresivních spermií (typ a), pomalu progresivních spermií (typ b),
spermií pohybujících se na místě (typ c), spermie nepohyblivé (typ d)
• Vzorek je vhodné hodnotit při 37°C (pokojová teplota by měla vliv na podíl rychle
a pomalu progresivních spermií)- s výhodou lze využít výhřevné ploténky na
mikroskopu
• Hodnocení je vhodné minimálně jednou zopakovat (na skle pracujeme s nízkým
objemem vzorku –méně reprezentativní)
Motilita spermií
• Při výpočtu motility spermií hodnotíme vždy na více zorných polích
• Počítá se minimálně 200 spermií a minimálně ve 2 opakováních (zhotoví se 2
preparáty)
• Lze využít i Maklerovu komůrku, ta má navíc mřížku, která může ze začátku
usnadnit odhad, zda se jedná o rychle nebo pomalu progresivní spermií
• Způsob hodnocení je různý- kategorie pohybu spermií se počítají postupně, např.
nejdříve se v zorném poli počítají rychle a pomalu progresivní spermie, následně
neprogresivní spermie a nakonec nepohyblivé spermie
• Nehodnotíme v oblastech do 5 mm od hrany
krycího skla!
• Lze využit „mřížku“, která se vloží do okuláru
Vitalita spermií
• Hodnotí se v případě snížené motility spermií
• Eosin-nigrosin staining – eosin proniká póry pod membrány mrtvých
spermií, nigrosin nátěr konturuje a usnadňuje odečítání
• 1:1 a ejakulátem, 30 s → roztěr
WHO manuál 2021
Morfologie spermií
Hodnocení morfologie spermií nemá význam pouze pro stanovení mužské plodnosti
(zde naopak se ukazuje, že nejspíše nebude nejsilnějším prognostický faktorem - s
výjimkou těžkých patologií).
Morfologie spermií má význam i pro výběr metody oplození a pro sledování funkční
ho stavu varlat a nadvarlat. V tomto ohledu nestačí pouhá detekce podílu
morfologicky normálních spermií, ale je třeba detekovat anomálie hlavičky, střední
části, bičíku a přítomnost cytoplasmatických residují.
Zhotovení nátěru spermií
• Vzorek ejakulátu důkladně homogenizujeme Pasteurovou pipetou
• Naneseme 10 µl ejakulátu na podložní sklo se zábrusem, provedeme roztěr
pomocí podložního skla se zkosenými hranami (aby se nepolámaly spermie) a
necháme důkladně zaschnout
• Následuje fixace a barvení
Při zhotovení nátěru vznikají v důsledku schnutí na vzduchu na spermií
určité tvarové změny.
- fixované spermie jsou menší než živé spermie
- nezralé spermie jsou naopak větší
- dochází ke ztrátě osmoticky citlivých cytoplazmatických kapének
Papanicolauovo barvení
• Nejvíce doporučováno je Papanicolauovo barvení – na
toto barvení byla adaptována Tygerbergerova striktní
kritéria
• Barví zřetelně všechny části spermií a dostatečně barví i
ostatní buněčné elementy
• Vysoká časová náročnost, v rutinní praxi těžko použitelné
• WHO manuál 2021
Rychlé komerční kity
• DiffQuick stain
• Alternativou pokud nemám prostory pro práci s fixativem jsou předbarvená skla
Hodnocení morfologie
• Provádíme vždy na obarveném roztěru –nativní ejakulát neumožňuje dostatečně
zhodnotit všechny anomálie
• Provádíme po zaschnutí preparátu
• Pod imerzí, objektiv 100x
• Procházíme preparát „cik cak“, abychom nehodnotili opakovaně jedno zorné pole
• Hodnotíme minimálně 200 spermií
• Stanovujeme podíl spermií s normálním tvarem, podíl spermií s patologií hlavičky,
krčku a bičíku nebo s cytoplazmatickou kapénkou
Normální spermie
Hlavička
- oválná, pravidelně ohraničená
- dobře diferencovaný akrozom, zabírající 40-70% plochy hlavičky spermie, neměl
by obsahovat velké vakuoly a více než 2 malé vakuoly (které by neměly zabírat
více než pětinu hlavičky spermie)
- postakrozoální region nesmí obsahovat žádné spermie
Střední oddíl
- štíhlý, pravidelný, přibližně stejně dlouhý jako hlavička
- hlavní osa by měla být zarovnaná s hlavní osou hlavičky
Bičík
- hlavní část bičíku by měla mít jednotný průměr
- měl by být tenčí než střední oddíl a měl by být asi 10 x delší než hlavička (45 µm)
- může být zahnutý, ale nemělo by být patrné zlomení bičíku (ostrý úhel)
Cytoplazmatická kapénka
- měla by být menší než 1/3 velikosti hlavičky
- u spermií člověka se vyskytují poměrně zřídka, často se odmyjí při barvení
Normální spermie
• WHO manuál 2021
• Papanicolau staining (WHO manuál 2021)
• Diff quick staining (WHO manuál 2021)
Obarvený preparát (Dip Quic) vs. nativní ejakulát
Bakterie v ejakulátu
• tyčinky, koky
→ kultivační vyšetření
Kulaté buňky
• Někdy bývají obtížně hodnotitelné.
• Polymorfonukleáry lze snadno zaměnit s multinukleovanými spermatidami.
• V případě Papanicoulauova barvení jsou PMN zabarveny spíše do modra a
spermatidy spíše do růžova.
• Rozlišení PMN je lepší podpořit například pomocí značení cytoplazmatické
peroxidázy pomocí ortho-toluidinu (nutné jsou však speciální prostory mimo
klinické vzorky nebo digestoř s filtrem pro organické sloučeniny).
• Rapid Romanowsky stained
preparations with ×100 objective
and ×10 optics. (A) Neutrophil
(A1), spermatid (A2). (B) Possible
lymphocyte (B1), multiple
spermatozoa (B2). (C) Large
phagocytic macrophage with
engulfed material (C1),
lymphocyte (C2). (D) Three
neutrophils (D1), two monocytes
(D2, D3). (E) Dividing
spermatocyte (E1), cytoplasmic
remnant (E2). (F) Possible
lymphocyte (F1), spermatid (F2)
Frontiers Publishing Partnerships | Round Cells in Diagnostic
Semen Analysis: A Guide for Laboratories and Clinicians
(frontierspartnerships.org)
• FIGURE 3. Papanicolaou stained
preparations with ×100 objective
and ×10 optics. (G) Neutrophil
(G1). (H) Two small neutrophils (H1,
H2). (J) Spermatid (J1), possible
degenerate/damaged neutrophil
(J2), neutrophil (J3), possible
degenerate monocyte
(J4). (K) Neutrophils (K1, K2),
spermatid (K3). (L) Cytoplasmic
remnant (L1), spermatocyte
(L2). (M) Spermatocyte (M1),
spermatids (M2).
Frontiers Publishing Partnerships | Round Cells in Diagnostic
Semen Analysis: A Guide for Laboratories and Clinicians
(frontierspartnerships.org)
Pro správnou intepretaci výsledku je nutné získat adekvátní vstupní informace!!!
Původní terminologie platná podle
WHO z roku 2010, 5th edition
-v novém manuálu se nepoužívá
- naučit ;)
Normozoospermie
Asthenozoospermie
Teratozoospermie
Oligozoospermie
Azoospermie
Aspermie
Leukospermie
Hemospermie
Necrozoospermie
Kryptozoospermie