Andrologie Soňa Kloudová sona.kloudova@med.muni.cz 4.4.2023 Selekce spermií in vivo • In vivo, spermie při své cestě k oplození oocytu zdolávají několik přirozených bariér - vagínou se přes cervix dostávají do dělohy a následně do ampuly vejcovodu, kde mohou setrvat až 6 dnů a vyčkávat na ovulaci, následně spermie musí zdolat další překážky v podobě ECM kumulárních buněk a ZP oocytu...během této cesty využívají mnoha fyziologických vlastností-pohyblivost, chemotaxe, kapacitace a akrozomální reakce, funkční receptory (vazba k ZP,k oolemě)... • Za 40 let praxe se zpracováváním spermií pro IVF se zdá, že lepší metoda výběru spermie ještě nebyla nalezena © • Soudobé metody selekce spermií jsou založeny nejčastěji na pohyblivosti spermií nebo na některé konkrétní funkční vlastnosti spermie Separace spermií pro ART • oddělení spermií od semenné plazmy (látky blokující kapacitaci a fertilizaci) • zisk optimálního počtu motilních spermií pro fertilizaci • oddělení spermií nízké kvality a ostatních buněk (vývojové p reku rzory, leukocyty, bakterie) • eliminace toxických a bioaktivních látek (např. ROS) • efektivní, rychlé, jednoduché a ekonomické • vzorek čerstvý vs. vzorek rozmrazený Výsledkem separace spermií je vzorek o určitém „zisku spermií" vypočteném z absolutních počtů spermií nebo z celkového počtu motilních spermií. Nejvyšší zisk metoda prosté centrifugace ejakulátu, nižší gradientní centrifugace spermií a jako nejnižší se zisk udává u metody swim-up. • V ejakulátu se vyskytuje kromě spermií ještě mnoho dalších složek a faktorů, které musí být odstraněny. • Zpracování spermií by mělo být zahájeno nejpozději do 1 hodiny po odběru (prevence poškození membrán v důsledku působení produktů ostatních buněčných elementů, včetně ROS) • V důsledku působení dekapacitačních faktorů v semenné plazmě s časem klesá vitalita a motilita spermií • I malé množství semenné plazmy může zabránit kapacitaci spermií (pozor u klasické fertilizace) • Správná separační technika by měla poskytovat co nejlepší zisk při minimálním poškození spermií. • Pozor na výkyvy teplot a nadbytečné centrifugace • Síla centrifugace by měla být co nejnižší, aby byla zároveň efektivní z hlediska zisku spermií a zároveň při ní vznikalo co nejméně ROS • Pozor na nastavení centrifugy (RCF vs RPM) • Metodu zpracování ideálně volíme podle orientačního zhodnocení kvality vzorku (koncentrace, pohyblivost, objem vzorku, viskozita) Základní metody: • Centrifugace spermií-Simple washing (dobré vstupní parametry, vhodné např. pro inseminace; nebo se využívá u vzorků o velmi nízkých koncentracích spermií, kde by ostatní metody nezaručily dostatečný zisk) • Gradientova centrifugace spermií ( vzorky s nízkýóu pohyblivostí, nízkou progresí, vysokým podílem nečistot, protilátkami proti spermiím) • Swim-up (dobrá až vysoká koncentrace a pohyblivost) Postupy základních metod čerpány z WHO manuálu 2021 WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Sixth Edition Ejakulat musí být odebrán do vhodné sterilní nádobky a stejně tak v průběhu zpracování musí být použity vhodné netoxické materiály (certifikace/vlastní validace). Pro zpracování spermií používáme certifikovaná média k tomu účelu určená. Quality System Approval Certificate Medical Devices Directive 93/42/EEC Postup práce si do určité míry laboratoř optimalizuje sama, vždy však v souladu s doporučením výrobce používaných médií (případně vlastní validace). -> Různí výrobci médií = různé pufrační systémy, různá doporučení vztahující se k teplotě uchování vzorku.. Ry Royal fhsrtpr EC Certificate - Production Quality Assurance Directive 93/42/EEC on Medical Devices, Annex V No. Issued To: BIRR Biosciences B.V. Bergseweg 4 3633 AK Vreeland The Netherlands CE 575680 In respect of: The manufacture of sterile micro-pipettes and puncture needles and sets for assisted reproductive technology and obstetrics; sterile foetal blood sampling kits; sterile pipettes, containers, tubes, dishes and serological pipettes for in-vitro fertilization procedures. Those aspects of Annex V concerned with securing and maintaining the sterility of laboratory medical devices and catheters for assisted reproductive technology and obstetrics; and operating theatre equipment covers. on the basis of our examination of the quality assurance system under the requirements of Council Directive 93/42/EEC, Annex V. The quality assurance system meets the requirements of the directive. For the placing on the market of class lib and class III products an Annex III certificate Is required. For and on behalf of BSI, a Notified Body for the above Directive (Notified Body Number 2797): Gary E Slack, Senior Vice President Medical Devices First Issued: 2016-05-16 Date: 2021-05-07 Expiry Date: 2024-05-26 ...making excellence a habit.' Pro ředění a centrifugaci ejakulátu se používají média HEPES pufrovaná (nebo podobným pufrem), 37°C, Pro naředění vyseparovaných spermií v závislosti na metodách laboratoře je možné použít média pufrovaná HEPES nebo bikarbonátovým pufrem (37°C, 6% C02) (nebo podobnými pufry) Teplota - uchování a zpracování vzorků je možné při pokojové teplotě nebo při 37°C - názory se různí Je třeba předcházet výkyvům teploty Bylo prokázáno, že při pokojové teplotě dochází k nižšímu poškození spermií ROS, existují však studie s protichůdnými závěry Turk J Obstet Gynecol. 2015 Mar. 12(1): 6-10. PMCID: PMC555340S Published online 2015 Mar 15. doi: 10.4274ŕtjod.31S44 PMID: 2B913033 The effect of preserving prepared sperm samples at room temperature or at 37 °C before intrauterine insemination (IUI) on clinical pregnancy rate Tayfun Cok,'* Pinar Caglar Aytac,1 Erhan Sirnsek.1 Bülent Haydardedeoglu,1 Hakan Kalayci.1 Halis Özdemir.1 and Esra Bulgan Kilicdag1 -> no difference Centrifugace spermií-Simple washing • Jednoduchá separační technika, poskytuje nejvyšší zisk spermií • Vhodná pro vzorky o dobré kvalitě a nebo pro vzorky ouplně špatné kvalitě, kdy zcentrifugování obsahu do pellety je jedinou možností jak získat dostatek spermií • Spočívá v prostém naředění ejakulátu promývacím médiem a následné centrifugaci vzorku • Sílu a čas centrifugace volíme podle vstupních parametrů ejakulátu, v úvahu bereme i viskozitu) Dochází ke koncentraci všech buněk, včetně buněčných úlomků, nezvyšuje sgjggfaHernií Metoda dle WHO 2021: naředit ejakulát s promývacím médiem 1+1 (1:2) -> rozdělit po 3 ml do zkumavek -> centrifugace 5-10 minut 300- 500 g -> odstranit supernatant -> přidat 1 ml média a resuspendovat sediment -> centrifugace 3-5 minut při 300-500g -> odsát supernatant a sediment naředit promývacím médiem na potřebnou koncentraci Gradientova centrifugace spermií • Centrifugace ejakulátu skrz hustotní gradient • Koloidní oxid křemičitý pokrytý silanem - typicky dvouvrstvý diskontinuální hustotní gradient (např. 80%(v/v) jako spodní vs. 40% (v/v) jako horní vrstva gradientu) • Separace buněk na základě průchodu hustotním gradientem + aktivní pohyb spermií Dobrá separace spermií od semenné plazmy, ostatních buněk a buněčných úlomků, bakterií, plísní i virů • Médium pro přípravu hustotního gradientu -buď přímo naředěné na požadované koncentrace a nebo koncentrované s nutností následného ředění • Pro gradientní centrifugaci vždy používáme kónickou zkumavku • Po přípravě kolony gradientu je nutná vizuální kontrola existence gradientového rozhraní Metoda dle WHO 2021: připravit hustotní gradient opatrným navrstvením 40% (v/v) gradientního média na 80% (v/v) médium -> umístit lml vzorku na kolonu gradientu -> centrifugace 300-400g 15-30minut -> odstranit supernatant -> sediment resuspendovat v 5 ml promývacího média -> centrifugace 200 g 4-10 minut -> stáhnout a zopakovat resuspendaci v 5ml média s následnou centrifugaci -> sediment resuspenovat v malém množství média, vyhodnotit a naředit na patřičnou koncentraci Semen Sample Centrifugation for 20 minutes at 1600 rpm t* Upper phase 40% Lower phase Seminal Plasma White blood cells, debris (a: raft) Abnormal non-motile sperm _Interphase (b: raft) Viable motile sperm Manual of Sperm Retrieval and Preparation in Human Assisted Reproduction, 2021) • Efektivní metoda zvyšující podíl motilních spermií i podíl spermií s normálním tvarem Modifikace metody: • Úprava hustotních gradientů umožňuje zisk vyššího počtu spermií nebo zisk spermií s vyšší motilitou např. gradient 90%/40 % -> nižší počet spermií o vyšší motilitě v porovnání s gradientem 80%/40% Úprava doby centrifugace -prodloužení-vyšší zisk spermií (viskózni vzorky) • Úprava výšky kolony gradientu Sc men sample 45% SpemiGrad™ 90%SpennOfad™ 300G, 20min ccntriťugation Kayer I Layer 2 seminal plasma interface abnormal inimotile sperm interface V. viable motile sperm pellet Schematics of sperm preparation by density gradient separation. One... I Download Scientific Diagram (researchgate.net) yy/j /y/i S s/i Sc«rmG#* / BSE Koloidní suspenze částic oxidu křemičitého pokrytého kovalentně vázaným silanem PureCeptrOn'" 80% Lower Phase Gradient HU% (^v) Mňr ctMtnd colloidal -ullĽ. ■n - t. i'i :. ti..n.-.-; lOT REF ART-2080 [lot] 15490076 Spefm Stpjrjtior 9 8 i ghMtaMll KM) j"T^fei»c by nbbit pyrogen lo" ŕ- : PureCeptíon™ 40% Upper Phase Gradient 40% (Wvi . ,..r. .1 uil: „■; , . „ ., Ml m 1 ■' ■ !• lf.-i- 1 1 i ' 1 REF ART-2040 ŕoi] 15460037 2 100 mL ISolate a (*l*|eiiic by rabbit pyrogen (f * ti o' mi inr sr«ri e* 1 r r V y v Elongated micropipette tip aspirates treated sperm Sperm pellet B Nidacon - Prolnsert - Eurasia J Biosci 14, 2385-2390 (2020) Gender selection by Percoll® gradients by using intraperitoneal insemination in mice: as a model of humar llaf Hassan Hadi \ Hayder A. L. Mossa 2* Table 2. Effect of Percoll® gradients centrifugation method on Pregnancy Rate and Gender Selection in Mice_ Groups Pregnancy Rate Total No. of Births No. of Males No. of Females Percoll® gradients method Treated Group 21 110 30 (30 female mice) (70%) ((72.7%r; I (27.3%) Direct Sperm Activation Technique 17 85 45 40 Control Group (56.7%) (52,9%) (47.1%) (30 female mice) P-Value P<0,05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 — Conclusions: Percoll® gradients method was founded 72.7% effective for male selection, despite of sperm X:Y ratio was unchanged after procedure, furthermore the pregnancy rate 70% was significantly more than using Direct Activation Technique. Swim-up • Metoda založená na aktivním pohybu spermií a jejich schopnosti vycestovat ze semenné plazmy do média • Ejakulát je umístěn pod médium, do kterého spermie volně vycestují • Šikmé uložení zkumavek zvýší plochu, skrze kterou je umožněno vycestování spermií • V ideálním případě by sperma před swim-up nemělo být ředěno a centrifugováno, protože může docházet k uvolňování ROS a poškozování membrán spermií • Preferuje se tzv. přímý swim-up, při kterém je buď přímo na ejakulát naneseno médium a neboje ejakulát pod médium podvrstven • Zisk spermií je sice nižší, ale dochází ke zvýšení podílu pohyblivých spermií Postup podle WHO 2021:1ml ejakulátu umístíme do konické centrifugační zkumavky -> opatrně navrstvíme 1,2 ml média -> zkumavku nakloníme do úhlu 45°C a inkubuje 1 hodinu při 37°C -> opatrně odebereme vrchní lml média a umístíme do čisté zkumavky -> naředíme 1,5 -2 ml média a centrifugujeme 300-500g 5 minut -> supernatant stáhneme a sediment se spermiemi naředíme 0,5 ml média -> zhodnotíme koncentraci a pohyblivost spermií, provedeme ředění na příslušnou metodu oplození https://www.researchgate.net/figure/Swi Tube-with-HTF-medium-and-an_figl_331470103 Modifikace metody: • Sekundární swim- up: jedná se o swim up spermií ze sedimentu získaného metodou prosté centrifugace nebo gradienti centrifugace spermií, cílem je zvýšení podílu motilních spermií ve vzorku, při této metodě je 1 ml média nanesen přímo na sediment spermií a nakloněná zkumavka je opět na hodinu umístěna do 37°C • V případě vzorků o vysoké kvalitě lze čas inkubace zkrátit-celková doba inkubace doba by však neměla přesahovat 1 hodinu • Potřebujeme-li zvýšit zisk, lze pro swim-up použít více zkumavek • Lze upravit objem ejakulátu/média • Metoda separace spermií by měla být volena také podle plánované metody fertilizace (např. plánujeme-li konvenční metodu oplození, rozhodně není vhodná metoda prosté centrifugace vzorku) • Vyseparovaný vzorek spermií je vždy lepší naředit a neponechávat jej po separaci vysoce koncentrovaný - v takovém případě je produkováno mnoho metabolitů, včetně ROS a dochází k rychlejšímu poklesu kvality vzorku •Pro metodu konvenčního oplození je kromě dostatečné koncentrace spermií důležitý i dostatečný podíl morfologicky normálních spermií a vysoký podíl progresivních spermií, samozřejmostí je také schopnost vazby k ZP, penetrace, fúze s oolemou,aktivace oocytu a formace pronuklea a funkční proximální centriol (pozor na morfologické defekty v oblasti krčku) Zpracování kryokonzervovaného vzorku • vzorek rozmrazíme v souladu s doporučením výrobce média (ředění vzorku po rozmrazení musí být velmi pomalé a plynulé) • po jeho promytí můžeme zakoncentrovyný vzorek zpracovat jakoukoliv zmíněnou metodou • Ideálně, za účelem zvýšení kvality vzorku volíme swim-up (sekundární swim -up) nebo gradientní centrifugaci (rozmrazený a promytý vzorek lehce naředíme a naneseme na kolonu) • O volbě metody může rozhodovat i vstupní kvalita vzorku před a po rozmrazení Zpracování sérologicky pozitivních pacientů • Pacienti pozitivna ha HIV, hepatitídu B nebo C, HTLV • Zabránění kroskontaminaci a vertikálnímu přenostu infekce •kombinace gradientní centrifugace následovaná metodou swim-up (WHO 2010), v současné době dostupných studiích, za použití této metody, dosud nedošlo k přenosu viru SeminN • stanovení virové nálože v kombinaci se zamrazením p|asma ejakulátu -> pokud negativní, lze vzorek zpracovat normálním způsobem Epithelial cell / lymphocyte semen after density gradient after swim up https://www.semanticscholar.org/paper/Separation-of-human-immunodeficiency-virus-type-l-a-Kuji- Kato/a57b2e0bfcf693a470264e550b8eb575a996902e/figure/0 Děkuji za pozornost