Přehled, indikace a interpretace genetických
vyšetření v diagnostice lymfoproliferací
Jana Kotašková
Sekce nádorové genomiky a lymfoproliferativních onemocnění
Centrum molekulární biologie a genetiky
Interní hematologická a onkologická klinika
Fakultní nemocnice Brno
24. 4. 2023
4th WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues
• mezinárodně uznávaná klasifikace
• 4. vydání 2008
• revize 4. vydání 2017
Neoplázie
ze zralých B-lymfocytů
• 36 jednotek
Campo et al. 2011
5th WHO classification
of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues (2022)
Allagio et al. 2021
5th WHO classification
of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues (2022)
Allagio et al. 2021
B lymfocyty v germinálních
centrech
Vznik B buněčného receptoru
Přestavby IG genů
Klonalita IG – základní diagnostické vyšetření
0
50000
100000
150000
200000
250000
150 200 250 300 350 400 450 500
224.B 12_10010510I0
Size (nt)
DyeSignal
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
65000
70000
200 250 300 350 400 450 500
9 8 9 .C 1 2 _ 1 0 0 1 0 5 1 0 H Z
Size (nt)
DyeSignal
Klonální vs. polyklonální nález
Poměr kappa/lambda
– fyziologicky kolem 2:1
Průtoková cytometrie Imunohistochemicky
Identifikace přestavby IG
– zhodnocení klonality lehkých i těžkých řetězců
– sekvenace V-D-J přestavby
– možnost sledování klonu u pacientů po terapii pomocí
citlivých metod (qPCR)
– IGH: Stanovení % somatických hypermutací (SHM) u CLL
Klonalita IG – základní diagnostické vyšetření
0
50000
100000
150000
200000
250000
150 200 250 300 350 400 450 500
224.B 12_10010510I0
Size (nt)
DyeSignal
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
65000
70000
200 250 300 350 400 450 500
9 8 9 .C 1 2 _ 1 0 0 1 0 5 1 0 H Z
Size (nt)
DyeSignal
Klonální vs. polyklonální nález
Poměr kappa/lambda
– fyziologicky kolem 2:1
Průtoková cytometrie Imunohistochemicky
Identifikace přestavby IG
– zhodnocení klonality lehkých i těžkých řetězců
– sekvenace přestavby
– možnost sledování klonu u pacientů po terapii pomocí
citlivých metod (qPCR)
– IGH: Stanovení % somatických hypermutací (SHM) u CLL
• Pokud je zachycena klonální přestavba, pak jde s velkou pravděpodobností o
lymfoproliferativní onemocnění
• Pokud je výsledek vyšetření „polyklonální, pak jde o normální B lyfocyty
nebo je špatně zvolený vyšetřovaný materiál
• Pokud není analýza hodnotitelná, bývá problém v materiálu (likvor bez
buněk, atp.)
Vznik aberací v lymfocytech
Somatické hypermutace
– Mutace v dalších genech mimo IG
Izotypový přesmyk
– Vznik translokací
Translokace se vznikem
fúzního genu
FISH
– Detekce pomocí speciálních
„break apart“ sond
Detekce transkriptu
– analýza RNA
– cíl pro sledování MRD
Translokace vedoucí k aberantní
genové expresi
FISH
Detekce translokace
– DNA
– Různé varianty PCR
– NGS
– Cíl pro sledování MRD
Detekce translokací t(8;14), t(11;14) a t(14;18)
• Pokud je translokace zachycena, lze ji využít jako cíl pro MRD monitoring
• Pokud je výsledek vyšetření negativní, pak
• translokace není přítomna
• translokace je mimo navrženou esej
• partnerem translokace je IGK/L (až 25 % translokací MYC u BL)
• je špatně zvolený vyšetřovaný materiál
Gruber and Wu. doi:10.1053/j.seminhematol.2014.05.004
Rekurentně mutované geny u
nejčastějších lymfoproliferací
MCL – mantle cell lymphoma
FL – follicular lymphoma
BL - Burkitt lymphoma
DLBCL – diffuse large B cell lymphoma
SMZL – splenic marginal zone lymphoma
CLL – chronic lymphocytic leukemia
WM – Waldenström macroglobulinemia
MM – multiple myeloma
Mutace v genu TP53
• Negativní prognostický a prediktivní marker
• Citlivost eseje závisí na metodě a frakci nádorových buněk ve vzorku
• Pokud je výsledek vyšetření negativní, pak
• mutace není přítomna
• mutace není přítomna nad limit metody (minoritní mutace)
• je špatně zvolený vyšetřovaný materiál
• Na vyšetření TP53 a na některé další geny rutinně separujeme nádorovou frakci – částečně nebo
plně
TP53 c.833C>G p.Pro278Arg VAF 94 %
Detail delece genu TP53
na chr. 17
Bialelická inaktivace TP53
Problém na druhé alele
• Pomocí sekvenování lze odhadnout (VAF > 50 %)
• delece druhé alely – FISH ověří
• monosomie – FISH ověří
• cnLOH (ztráta heterozygotnosti) – SNP analýza
komplexní analýza markerů
lymfoidních malignit
detekce mutací, chromozomových
abnormalit, klonality IG a TCR,
a vybraných translokací
citlivá analýza v jediném
experimentu
jednoduché zpracování dat pomocí
webového softwaru
interaktivní analýza a zobrazování
výsledků
kompletní informace o prognóze
pacienta
PANEL LYNX
(LYmfoidní NGS panel)
přestavby IG a TR translokace
AGTAATATGCCT
ACCAATATAACT
AG-ACCATATG-
CT
mutace, inserce, delece chromozomové
abnormality
interaktivní zobrazování výsledků
výsledková
zpráva ke
stažení
klinická praxe
výzkum
Podpořeno z programového projektu TACR ZETA TJ02000133.
Nalezené aberace reportujeme podle guidelines
• primární CNS
• obtížně bioptovatelný lymfom, progrese do CNS
• volná mimobuněčná DNA
– uvolňuje se z buněk podstupujících apoptózu,
nekrózu
– ve všech tělních tekutinách – plazma, likvor,
moč, sliny
– fragmentovaná – cca 170bp
– poločas rozpadu < 2,5 hod
– u zdravých lidí v malém množství
(1 -10ng/ml plazmy)
Detekce aberací z volné DNA
Izolace volné DNA z plazmy nebo likvoru
– komplexní obraz o nádoru v těle
– souhrnný obraz z více ložisek
110 pg/ul
(cfDNA likvor)
Droplet digital PCR
• sledování tzv. hot spot variant, citlivost až 1*10-5
• MYD88 L265P u WM – vzorky s nízkou infiltrací
• MYD88 L265P u primárních lymfomů CNS v likvoru (přítomna až u 80 % pts)
• sledování potvrzených rekurentních hotspot v plazmě (BRAF, KRAS, NRAS,..)
Detekce MYD88 L265P v likvoru
pacienta s PCNSL
Pacient s agresivním lymfomem
• muž, ročník 55, dg v 2021, 66 let
• leukemizovaný lymfom DLBCL/BL/HGBL,
masivní ložiska v mesenteriu, po terapii
regrese
• biopsie nebyla možná pro špatný stav
• vyšetření dřeně cytogeneticky: komplexní
karyotyp, t(8;22) a t(14;18)
• časná progrese do CNS
Biologický materiál kostní dřeň
(DNA)
likvor (cfDNA) plazma (cfDNA)
Mutace Gen HGVSc HGVSp Frekvence (%) Frekvence (%) Frekvence (%)
KMT2D c.8936_8937del p.Leu2979ArgfsTer10 21.7 32.7 ND
BTG1 c.428T>A p.Val143Glu 34.5 48.5 ND
CREBBP c.2177_2184del p.Pro726LeufsTer103 23.2 45.8 ND
BCL2 c.392C>T p.Ala131Val 27.3 36.1 ND
ASXL1 c.1534C>T p.Gln512Ter 6.3 3.6 32.1
EP300 c.3610T>G p.Cys1204Gly 33 47.3 ND
Translokace Gene partners koordináta koordináta partnera Frekvence (%) Frekvence (%) Frekvence (%)
IGH/BCL2 14:105,863,241 18:63,120,802 63 100 ND
CNAs Lokalizace na genomu
(hg38)
Typ Dotčené geny (LYNX) Frekvence (%) Frekvence (%) Frekvence (%)
chr2:58183800-68149300 zisk XPO1 70 100 ND
chr8:4617400-145005800 zisk PAG1, UBR5, MYC 70 80 ND
chr12:38525800-73670100 zisk KMT2D, STAT6 80 90 ND
chr1:0-49650114 CN-LOH TNFRSF14, ID3 70 100 ND
chr9:21726012-22249845 biallelická ztráta CDKN2A, CDKN2B 80 100 ND
chr13:47033917-48010829 ztráta - 30 80 ND
IG přestavby Lokus V gen J gen Frekvence (%) Frekvence (%) Frekvence (%)
IGK IGKV2-26 - 97 91 ND
IGL IGLV3-22 IGLJ3 72 46 ND
CN-LOH - copy-neutral loss of heterozygosity; ND - nedetekováno
Záchyt Progrese do CNS
NGS panel - DNA z KD a volná DNA z plazmy a likvoru
Stanovení klonality IG/TR
– abnormální kumulace lymfocytů nesoucích jednu konkrétní
přestavbu
Identifikace přestavby IG/TR
– možnost sledování klonu u pacientů po terapii pomocí citlivých
metod
Detekce translokací a fúzních genů
– lymfomy: MCL t(11;14), FL t(14;18), BL t(8;14)
– sledování zbytkové choroby
Analýza rekurentně mutovaných genů
– TP53 – negativní prognostický a prediktivní marker
– MYD88 – primární CNS lymfomy, WM, MZL
Komplexní analýza pomocí NGS panelu
– diagnóza, prognóza
Přehled vyšetření u lymfoproliferací
0
50000
100000
150000
200000
250000
150 200 250 300 350 400 450 500
224.B 12_10010510I0
Size (nt)
DyeSignal
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
65000
70000
200 250 300 350 400 450 500
989 .C 12 _1001 0510 H Z
Size (nt)
DyeSignal
Klonální vs. polyklonální nález
Sledování zbytkové choroby (MRD) v terapii
Mutace vedoucí k
rezistenci
BCL2
mcr exMBR ex
mcr inMBR in
JH
ex
JH in
5´
3
´ 3
´
5´
chromozom 18 chromozom 14
Detekce translokace t(14;18)(q32;q21) u FL
Mutace v genu TP53
Diagnostika integrující
 propojování informací z hematologie, průtokové
cytometrie, patologie, cytogenetiky a genetiky
Diagnostika šitá na míru
 výběr relevantních markerů a metod jejich detekce
Identifikace privátních aberací jedinečných pro daného pacienta
 přestavba IG/TR
 sledování zbytkové choroby
Zpracování biologického materiálu podle potřeb vyšetření
 separace nádorových buněk
 paralelní vyšetření různých materiálů
Personalizovaná medicína u lymfoproliferací v praxi
Shyr, D., Liu, Q. doi.org/10.1186/1480-9222-15-4
Snad už brzy…..
Cílem detailní a personalizované diagnostiky
 přesná klasifikace
 stanovení prognózy
 volba léčebné strategie
 sledování odpovědi na léčbu
 prevence relapsu
Děkuji za pozornost