Laboratorní diagnostika
(molekulárně genetické metody)
I.
CMBG, IHOK, FN Brno
Ing. Ivana Ježíšková, Ph.D.
24. 4. 2023
HEMATOONKOLOGICKÁ ONEMOCNĚNÍ
• systémová klonální onemocnění hematopoetické tkáně
Charakteristika
Členění
- podle charakteru:
• DIFÚZNÍ (leukemie)
• LOŽISKOVÁ (lymfomy)
- podle postižené krevní vývojové řady:
• MYELOIDNÍ (postižena je myeloidní prekurzorová buňka)
• LYMFOIDNÍ (postižena je lymfoidní prekurzorová buňka)
Rozdělení
• AKUTNÍ
- rychle probíhající onemocnění
- vývoj nezralých elementů (blok a ztráta diferenciace)
- neléčené onemocnění způsobuje smrt nemocného v týdnech/měsících
- podle stavu/průběhu onemocnění:
• CHRONICKÁ
- probíhající pomalu, postupně
- vyzrávající buňky se ztrátou apoptózy
- neléčené onemocnění umožňuje přežití nemocného v řádech
měsíců/ let
LEUKÉMIE (C91-C95)
ONKOLOGICKÁ ONEMOCNĚNÍ
Incidence nádorů v ČR (2009-2013)
Zdroj: Národní onkologický registr, ÚZIS ČR
LEUKÉMIE
• 13/ 100 000 obyvatel, tj. 1 300 nových případů leukémií v ČR za rok
• děti (0-18): 5 / 100 000 dětí, tj. 80 nových případů leukémií u dětí v ČR za rok
Incidence
Zdroj: Geryk E et al, Onkologie, 2013; 7(3).
METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Charakteristika
• vědní disciplína zabývající se studiem biologických procesů na
molekulární úrovni
• popisuje strukturu biomakromolekul (DNA, RNA, proteinů), jejich
funkce a vzájemné interakce
Zdroj: www.dreamstime.com
• pojem „molekulární biologie“:
1938 Warren Weaver
1939WilliamThomas Astbury
• vědní obor – poč. 60 let 20. stol.
1953 – struktura a vlastnosti DNA
J. D.Watson, F. H. C. Crick
1958 – ústřední dogma molekulární
biologie – F. H. C. Crick
NUKLEOVÉ KYSELINY (NK)
Extrakce nukleových kyselin
• první krok molekulárně biologických analýz
• cílem je získat NK v dostatečném množství a kvalitě
Zdroj: info.gbiosciences.com
• Friedrich Miescher, r. 1865 - z jader leukocytů vyizoloval směs látek
bohatých na fosfor - nuklein
EXTRAKCE NUKLEOVÝCH KYSELIN
Přístupy/ metody
• tradiční přístup – fenol/ chloroformová extrakce
vysolování (DNA)
• výhody: vysoká výtěžnost a čistota, levná
• nevýhody: časová náročnost, práce s nebezpečnými látkami
• nové metody – adsorpce na kolonku se silikátem
vazba na magnetické partikule
• výhody: nenáročná, rychlá, bezpečná
• nevýhody: finanční náročnost
AUTOMATIZACE EXTRAKCE NK
Automatické izolátory
• QIAcube (Qiagen) – silikátové kolonky
• Maxwell (Promega) – magnetické částice
METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Polymerázová řetězová reakce - PCR
• jednoduchá metoda rychlého zmnožení určitého úseku DNA
• objevitel – Kary Banks Mulis, 1983 (publikace 1985, Science)
• 1993 Nobelova cena za chemii, za objev techniky PCR
Kary Mullis (*1944)
POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE
Přístroje
• amplifikace probíhá v termocyklerech
Trio 48 (Biometra) T100 (Bio-Rad)
GeneAMP 9600 (Perkin Elmer)
Vizualizace PCR produktů
• stanovení gelovou elektroforézou:
• princip: díky fosfátových skupinám je DNA záporně nabitá. V elektrickém
poli se pohybuje směrem ke kladně nabité elektrodě.
• agarózové gely (horizontální elfo)
• polyakrylamidové gely (vertikální elfo)
• separace na základě velikosti fragmentů: rychlost je nepřímo úměrná
jejich velikosti (delší fragmenty lokalizujeme blíže startu elektroforézy)
POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE
METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Real-time PCR (kvantitativní PCR)
• průběžný monitoring množství amplifikovaného PCR produktu
• součástí PCR reakce jsou fluorescenční barviva/ sondy
• množstevní přírůstek je měřen jako zvyšující se intenzita fluorescenčního
záření
QuantStudio 3 (Applied
Biosystems)
Rotor gene Q (Qiagen) ABI7300 (Applied
Biosystems)
REAL-TIME PCR
Absolutní kvantifikace
• vzorky o neznámé koncentraci jsou porovnány se standardy o
známé koncentraci.
• koncentrace - vyjádřená počtem kopií analyzovaného úseku je
intrapólována ze standardní křivky.
Zdroj: www.sabiosciences.com
METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Sekvenování
• r. 1975 – F. Sanger a A. R. Coulsen vyvinuli biochemickou metodu
sekvenování NK (dideoxy metoda)
• sekvenování manuální – gely
• r. 1986 – sekvenování automatizované
(v kapilárách) – první fluorescenční
sekvenátor (AB370A, Applied Biosystems)
Fred Sanger (*1918-†2013)
Zdroj: www.abrngood.com
SEKVENÁTORY PRVNÍ GENERACE
• sekvenování - čtení pořadí jednotlivých nukleotidů v NK
• čteny jsou úseky dlouhé max. 600 – 700 nukleotidů
ABI 3130XL (Applied Biosystems) – 16 kapilár
• fragmentační analýza – automatizovaná elektroforetická separace různě
dlouhých fluorescenčně značených DNA fragmentů
Možnosti
SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE (NGS)
Možnosti
• sekvenování několika miliónů nukleotidů současně
• široké spektrum využití:
• targetované, exomové, celogenomové sekvenování
• studium metylace DNA
• RNAseq
• sekvenování plazmidů, mitochondrií, jednotlivých chromozomů
• metagenomika (analýza genetické diverzity)
2011
1953
1977
1987
2007
2005
2012
Struktura
DNA
Sangerovo
sekvenování
První automatický
fluorescenční
sekvenátor,
AB370A
454 (Roche)
Solexa
(Illumina)
Solid
(Life
Technol.)
Ion
Torrent
(Life
Technol.)
Pac Bio (Pacific
Biosciences)
SEKVENÁTORY NOVÉ GENERACE (NGS)
Illumina sekvenátorry
• 90% všech dnes získaných NGS dat vychází ze strojů f. Illumina
Zdroj: www.illumina.com
METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Droplet Digital PCR (ddPCR)
• amplifikace jednotlivých prostorově oddělených molekul NK
• výsledek každé amplifikace se hodnotí zvlášť
QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-RAD)
MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA LEUKÉMIÍ
Charakteristika metod
• metody jsou vysoce senzitivní, specifické
• analýzy rychlé (výsledky v řádu hodin)
Význam
• stratifikace pacientů dle rizika do prognostických skupin
• nastavení vhodné terapie
• sledování minimální zbytkové choroby (úspěšnost léčby)
• predikce návratu (relapsu) onemocnění
AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Charakteristika
• heterogenní skupina maligních klonálních onemocnění
• nepříznivé maligní onemocnění
• charakterické proliferací a akumulací nezralých myeloidních
prekurzorů v kostní dřeni (následné vyplavování do periferní krve)
• prudká manifestace onemocnění (dny/týdny)
• představuje 2-4% všech maligních tumorů
• pětileté přežití 20-30%
AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Incidence – vývoj v čase
• 3/ 100 tis. obyvatel
AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Incidence – dle věkové struktury
• s věkem stoupá
AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Somatické aberace – identifikace v čase
Zdroj: Grimwade D., et al. Blood. 2016, 127: 29-41.
AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Mutace – identifikace v čase
Zdroj: Grimwade D., et al. Blood. 2016, 127: 29-41.
NGS
AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Třídy mutací
Zdroj: Chen JS., et al. Nature Genetics. 2013, 45: 586-7.
AML – KLONÁLNÍ VÝVOJ
Vznik AML
Zdroj: Grimwade D., et al. Blood. 2016, 127: 29-41.
MUTACE V PRELEUKEMICKÝCH BUŇKÁCH
McKerrel T, et al. Cell Rep, 2015
AML - DIAGNOSTIKA
Prognostická klasifikace pacientů s AML – ELN 2022
KLASIFIKACE PACIENTŮ S AML
Pacienti s příznivou prognózou
• pacienti s aberacemi: t(8;21) – RUNX1/ RUNX1T1 (AML1/ETO)
inv(16), t(16;16) – CBFB/MYH11
bialelická mutace CEBPA
Zdroj:
Grimwade et al.
Blood, 2010.
KLASIFIKACE PACIENTŮ S AML
Pacienti s nepříznivou prognózou
• pacienti se změnami: inv(3), t(3;3) – RPN1/EVI, t(6;9) – DEK/NUP214
t(*;11) – přestavby MLL genu, komplexní karyotyp
-5 nebo del(5q); -7, abnl (17p)
Zdroj:
Grimwade et al.
Blood, 2010.
AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Molekulární markery
prognostické markery
stabilní markery → vhodné pro sledování minimální reziduální
nemoci (MRN)
• Fúzní transkripty
• Význam:
• Somatické mutace v genech
Zdroj:
Buckley SA, et al. Bone Marrow
Transpl. 2013.
MOLEKULÁRNÍ MARKERY
Fúzní transkripty
• t(8;21) – RUNX1/RUNX1T1 (AML1/ETO) (6% všech AML)
• inv(16) nebo t(16;16) – CBFB/MYH11 (7% všech AML)
• t(*;11) – přestavby MLL genu
Zdroj:
www.protein.bio.msu.ru
FÚZNÍ TRANSKRIPTY
RUNX1/RUNX1T1 (AML1/ETO)
• fúzní protein je kompetitivním inhibitorem normálního transkripčního
faktoru AML → blokáda exprese cílových genů → zástava maturace
leukocytů
SOMATICKÉ MUTACE V GENECH
Geny
• NPM1 – exon 12 (mutován u cca 30 až 35% všech AML)
• FLT3 – FLT3-ITD - in frame mutace v exonech 14,15 (20-25%)
• TP53
• IDH2 – kodony R140, R172 v exonu 4 (9%)
• IDH1 – kodon R132 v exonu 4 (6%), …
Mutace v genu DNMT3A
Zdroj:
Ley TJ, et al. NEJM, 2009
SOMATICKÉ MUTACE V GENECH
Gen FLT3
• membránový receptor s tyrosin kinásovou doménou. Aktivační
mutace vede k fosforylaci receptoru, aktivaci signálních drah a
nekontrolovatelné proliferaci buněk
SOMATICKÉ MUTACE V GENECH
IDH1/2
• isocitrát dehydrogenáza – enzym zodpovědný za dekarboxylaci
isocitrátu na alfa-ketoglutarát. Mutovaný gen vede ke katalýze
isocitrátu na toxický 2-hydroxyglutarát
Predispozice k AML
Zdroj: Tawana et al. Blood. 2015.
FAMILIÁRNÍ VÝSKYT AML
Gen CEBPA
Zdroj: Tawana et al. Blood. 2015.
GERMINÁLNÍ MUTACE
45 % nosičů mutace v genu
CEBPA onemocní AML
10 % AML pacientů s mutací
v genu CEBPA nese mutaci
germinálního původu
WHO klasifikace – aktualizace 2016
Zdroj: Döhner et al. Blood. 2017.
GERMINÁLNÍ MUTACE
• 1 – 2 % všech případů AML je familiárního původu
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Historie
• r. 1960 Nowell a Hungeford detekovali malý chromozóm v kostní dřeni
pacientů s CML
• podle místa objevu označen jako Filadelfský (Ph) chromozón
• r. 1973 Rowleyová - podstatou pH chromozomu je translokace mezi
chromozomy 9 a 22: t(9;22)(q34;q11)
P. C. Nowell a D.A. Hungerford
• poč. 80 let – identifikace fúzního genu BCR/ABL1
J. D. Rowleyová
• 2001 zavedení imatinibu (glivec)
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Charakteristika
• klonální myeloproliferativní onemocnění; nádorové buňky nesou
Filadelfský chromosom (Ph), tj. reciprokou translokaci t(9;22),
důsledkem translokace je vznik fúzního genu BCR/ABL1
• fúzní gen kóduje trvale aktivní proteinkinásu BCR/ABL1
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Incidence – vývoj v čase
• 1,1-1,5/ 100 tis. obyvatel
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Incidence – dle věkové struktury
• 75% nemocných je starších 50 let
• mírná predispozice u mužů (1,4:1)
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Fáze onemocnění
tři klinická stádia onemocnění
- až 95% nemocných je zachyceno v chronické fázi
Zdroj: www.zdn.cz
- moderní přístup analýzy PCR amlikonů na gelech - systém QIAxcel
(QIAGEN)
- rychlá analýza bez nutnosti práce s nebezpečnými látkami
- finančně náročnější
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Molekulární diagnostika
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Molekulární diagnostika
• kvantitativní analýza exprese fúzního transkriptu BCR/ABL1
- rutinně metodou real-time RT-PCR
- předpokladem je znalost typu zlomu
Molekulární diagnostika
- alternativa k real-time PCR - systém GeneXpert (Cepheid) –
uzavřený, cartridge systém
- automatizovaná platforma zahrnující všechno kroky analýzy exprese
fúzního transkriptu BCR/ABL1
vzorek
reagencie
- výsledky analýzy k dispozici za cca 2 hodiny od odběru
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Molekulární diagnostika
- citlivá analýza exprese fúzního transkriptu BCR/ABL1: ddPCR
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
- absolutní kvantifikaci počtu molekul fúzního transkriptu bez nutnosti
tvorby amplifikační křivky
- optimální pro kvantifikaci nízké koncentrace cílového úseku
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Léčba tyrozinkinázovými inhibitory (TKI)
- zavedení tyrozinkinázových inhibitorů do léčby pacientů s
CML významně vylepšilo jejich prognózu
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Léčba tyrozinkinázovými inhibitory (TKI)
- zavedení tyrozinkinázových inhibitorů do léčby pacientů s
CML významně vylepšilo jejich prognózu
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Rezistence na léčbu (TKI)
- mutace v kinázové doméně BCR/ABL1 (více jak 100 mutací)
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
Rezistence na léčbu (TKI)
- nejzávažnější mutaceT315I
Zdroj: de Lavallade et al., Oncology, 2016.
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
TKI-vedlejší účinky
CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE
TKI-vysazování
- pacineti mohou benefitovat z vysazeníTKI
- formou klinických studií – FN Brno: studie HALF
DĚKUJI ZA POZORNOST