DNA analýza při diagnostice mendelovsky dědičných (monogenních) onemocnění Iveta Valášková Člověk Buňka Genetická informace uložena v jádře a mitochondriích Buněčné jádro obklopené mitichondriemi Lidský genom Soubor všech genů daného organismu Veškerá genetická informace (obsažená v DNA) v lidských buňkách • jaderný • mitochondrialní Buněčné jádro obklopené mitichondriemi Lidský genom Buněčné jádro obklopené mitochondriemi Mitochondrie V každé buňce se nachází mnoho mitochondrií, Každá obsahuje mitochondriální DNA Jádro Každá DNA molekula je sbalena do chromosomu Každý ze 46 chromosomů člověka je tvoře jednou molekulou dvoušroubovicové Chromosom Chromozóm je složen z DNA a histonových bílkovin, které tvoří jakousi kostru, na níž se molekula DNA namotává. Člověk má v každé buňce dvě sady - 23 párů chromosomů, tj. celkem 46 Pohlavní buňky obsahují jednu sadu chromosomů Deoxyribonukleová kyselina DNA Uvnitř jádra většiny buněk a mitochondrií je svinutá 2 m dlouhá spirála. • V její části je zakódováno, kdo jsme a jak vypadáme. • Obsahuje vzorce opakující se v jedinečném, pro každého jedince individuálním počtu. Deoxyribonukleová kyselina DNA je pro život nezbytnou látkou je nositelkou genetické informace všech organismů je to molekulární paměť disponující úžasnou kapacitou ve své struktuře kóduje a zadává buňkám jejich program a tím předurčuje vývoj a vlastnosti celého organismu Struktura DNA DNA je jako stočený spirálovitý žebřík se třemi miliardy příčlí Příčle tvoří látky nazývané báze. Jsou čtyři druhy bází [adenin (A), guanin (G), cytosin (C), tymin (T)] Přesný pořádek se liší u každého jedince kromě identických jednovaječných dvojčat. Lidská DNA obsahuje 6, 4 miliardy bazí Kódující a nekódující DNA Genom Chromosom Gen Gen Extragenová oblast Oblasti kódující znaky jsou uvnitř genů - tvoří 1,5% lidské DNA Gen Je základní jednotka genetické informace (základní jednotka dědičnosti). Je to určitý úsek DNA (sekvence nukleotidů) na chromosomu gen se může vyskytovat v různých formách – alelách soubor všech alel v buňce daného jedince označujeme jako genotyp vnější projev genotypů, soubor všech znaků organismu označujeme jako fenotyp soubor všech genů daného organismu nazýváme genom genom člověka je tvořen jaderným genomem a mimojaderným genomem (mitochondriálním) Monogenní dědičnost jeden gen může podmiňovat vytvoření jednoho konkrétního znaku Polygenní dědičnost realizace znaku po spolupůsobení většího počtu genů častěji je vznik znaku závislý na genových interakcích, tzn., že o konkrétní podobě znaku rozhodují alely více zúčastněných genů Alela gen alela 1 alela 2 Forma genu Každý gen se vyskytuje v různých konkrétních formách alelách Gen podmiňuje určitý znak Alela obsahuje „návod“ k vytvořen určité konkrétní podoby znaku Alela • dominantní - převažující • recesivní - ustupující • kodominance – alely se společně podílejí na konečné podobě znaku Homozygot Jedinci se shodným párem alel příslušného genu Heterozygot Jedinci s odlišnými alami příslušného genu Gen  Strukturární geny obsahují informace o primární struktuře proteinů, popř. polypeptidů  geny kódující proteiny se stavební funkcí základní složky cytoskeletu a mezibuněčné hmoty (tubulin, kolagen, elastin, aktin,myosin) geny kódující proteiny s biochemickou nebo fyziologickou funkcí enzymy, buněčné receptory, regulační proteiny, protilátky, hormony  Geny pro funkční RNA jejich transkripční produkty nepodléhají translaci geny kódující tRNA a rRNA Gen - struktura Exony úseky kódujících sekvencí jsou jen malým zlomkem délky celého genu Introny nekódující sekvence nejsou překládány do proteinu velikost 80-10 000 nukleotidů Přenos genetické informace Genetická informace je přenášena z generace na generaci v nezměněné formě replikace DNA Tok genetické informace RNA RNA se liší od DNA v těchto aspektech: nukleotidy v RNA se nazývají rybonukleotidy, protože cukernou složkou je riboza v RNA se vyskytují báze adenin cytosin guanin thymin nahrazen uracilem RNA jednořetězcová molekula na základě párování bazí se může sbalit do různých tvarů Typ RNA Funkce mRNA kódování proteinů rRNA součást ribozomů, účast na proteosyntéze tRNA adaptor mezi mRNA a aminokyselinou při proteosyntéze malé RNA účast na sestřhu pre-RNA, účast na transportu proteinů do ER Čtecí rámce Při translaci je nukleotidová sekvence mRNA čtena z 5´konce po trojicích nukleotidů Genetický kód  je reprezentován 64 kodóny • vyjadřuje 20 standartních aminokyselin  je degenerovaný táž aminokyselina je kódována několika kodóny  kodóny UAA, UAG, AGA jsou nesmyslné  je univerzální pro všechny organismy Genetický kód Univerzální pro všechny organismy Degenerovaný Typy mutací 1) Genomové – dojde ke změně celého genomu (haploidizace, polyploidizace) 2) Chromozomové – mutační změna postihla strukrutu chromozomu (chromozomové aberace) 3) Genové – mutační změna v genu a) Somatické - vznikají v somatických buňkách - mutantní změnu obsahují pouze části tkání, které vznikly dělením původní mutantní buňky b) Gametické - vznikají v gametách - všechny buňky jedince, který vznikla z příslušné zygoty, obsahují mutantní změnu Genové mutace Typy mutací  delece od 1 bp po megabáze  inzerce včetně duplikácí  jednobázové substitutce missense transverze nonsense tranzice splice site silent  posunové (frameshift) v důsledku delecí, inzercí, poruch splicingu  „dynamické“ (expanzia rep. sekv.) tandemové repetice, které často expandují během meiózy Podle sekvence: -v kódující sekvenci - v nekódující sekvenci Mutace Typy mutací wildtype substituce delece inzerce nonsense G542X missense N1303K dF508 390insT gen protein protein defektní redukován chybí Člověk Buňky v lidském těle: 75 – 100 biliónů Lidský genom: jádro, mitochondrie Geny v lidském genomu: 20 000 Chromosomy v jádře: 46 Genetická informace jako kniha Our genome -> The book Our chromosomes -> The chapters of the book Our genes -> The sentences in the book Our DNA -> The letters forming the words and sentences A mutation -> A typographical error A variation -> A spelling variation Jerome Lejeune, nositel Nobelovy ceny za genetiku Za nejdokonalejší buňku považoval oplodněné vajíčko, z něhož se vše vyvíjí. Říkal, že „každý z nás má přesný výchozí bod, což je doba, kdy jsou všechny potřebné a vhodné genetické informace shromážděny v jedné buňce, oplodněném vajíčku, a to je okamžik oplodnění. O tom neexistuje nejmenších pochyb a víme, že tato informace je zapsána na stužce DNA Buňka Oplození předání genetické informace z generace na generaci Od svých rodičů dostáváme do výbavy od každého 23 chromosomů z toho jeden pohlavní (X nebo Y od otce, od matky vždy X) Mendelian inheritance Mendelovská dědičnost • Zákon dominance • Zákon segregace • Zákon o volné kombinovatelnosti vloh Mendelovská dědičnost Dělí se do čtyř skupin. autozomálně dominantní (familiarní hypercholesterolemie, achondroplazie, Marfanův syndrom aj.) autozomálně recesivní (hemochromatoza, cystická fibróza, fenylketonurie), gonozomálně (tedy postižením pohlavních chromozomů) dominantní (např. vitamín D resistentní rachitida) gonozomálně recesivní (barvoslepost, Duschenova muskulární dystrofie, hemofilie) onemocnění. Mendelian inheritance Mendelovská dědičnost Oplození Jak se předává genetická informace uložená v mitochondriálním genomu U většiny mnohobuněčných organismů je mtDNA zděděna od matky (maternálně dědičná). • Vajíčko obsahuje průměrně 200 000 mtDNA molekul, zatímco zdravé lidské spermie obsahují v průměru 5 molekul mtDNA, protože dochází k degradaci mtDNA spermií v mužském pohlavním traktu. • Mužská mtDNA je společně s bičíkem spermie ztracena při vstupu do vajíčka. Jaderná a mitochondriální dědičnost Dědičná onemocnění onemocnění, která jsou přenášena (děděna) v rámci rodiny z rodičů na potomky. Genomové (polyploidie, aneuploidie) – dojde ke změně celého genomu (početní aberace) Chromozomové – mutační změna postihla strukturu chromosomu (strukturní aberace) Genové – mutační změna v genu (změny sekvence DNA) Genové mutace Typy mutací  delece od 1 bp po megabáze  inzerce včetně duplikací  jednobázové substitutce missense transverze nonsense tranzice • sestřihové • silent  posunové (frameshift) v důsledku delecí, inzercí, poruch splicingu  „dynamické“ (expanzia rep. sekv.) tandemové repetice, které často expandují během meiózy Podle sekvence: -v kódující sekvenci - v nekódující sekvenci Mutace Typy mutací wildtype substituce delece inzerce nonsense G542X missense N1303K dF508 390insT gen protein protein defektní redukován chybí Dědičná x geneticky podmíněná onemocnění a) Somatické - vznikají v somatických buňkách - mutantní změnu obsahují pouze části tkání, které vznikly dělením původní mutantní buňky b) Gametické - vznikají v gametách - všechny buňky jedince, který vznikl z příslušné zygoty, obsahují mutantní změnu - onemocnění, která jsou přenášena (děděna) v rámci rodiny z rodičů na potomky Diagnostika genetických onemocnění početní strukturní sekvenční změny DNA aberace chromosomů Cytogenetika Molekulární cytogenetika Molekulární diagnostika Diagnostika genetických onemocnění početní strukturní sekvenční změny DNA aberace chromosomů Cytogenetika Molekulární cytogenetika Molekulární diagnostika Diagnostika genetických onemocnění Cytogenetika Molekulární cytogenetika Molekulární diagnostika Kary Banks Mullis 1983 technika,která umožňuje mnohonásobnou amplifikaci specifických úseků DNA Tato metoda byla ve své době doslova převratná a nejen že měla obrovský dopad na vědeckou komunitu, ale ovlivnila i mnoho aspektů našeho každodenního života. PCR (polymerázová řetězová reakce) Událost popisuje tak, že během cesty po dálnici 128 ze San Francisca do Mendocina v jeho Hondě Civic ho náhle polymerázová řetězová reakce napadla tak jasně, jako by jí měl v hlavě nakreslenou na tabuli. Kary Banks Mullis Mullis za vynález PCR obdržel Nobelovu cenu v roce 1993, deset let po své cestě ze San Francisca do Mendocina. IS-PCR Typická PCR amplifikace využívá oligonukleotidové primery, které hybridizují k protilehlým řetězcům. Primery pak bývají orientovány tak, aby směr jejich prodlužování mířil dovnitř, kde se mezi oběma primery nachází požadovaná sekvence. Jelikož je pak produkt jednoho primeru zároveň templátem pro primer opačný, následuje po opakování cyklů denaturace, nasedání primerů a jejich prodlužování exponenciální namnožení kopií oblasti ohraničené těmito primery. http://2007.igem.org/wiki/index.php/McGill/PCR Deoxyribonukleová kyselina DNA Uvnitř jádra většiny buněk a mitochondrií je svinutá 2 m dlouhá spirála. • V její části je zakódováno, kdo jsme a jak vypadáme. • Obsahuje vzorce opakující se v jedinečném, pro každého jedince individuálním počtu. Jsem biodetektiv, jmenuji se DNA a usvědčím každého! DNA fingerprinting 10. září roku 1984 v 9 hodin a 5 minut, kdy si britský genetik Alec Jeffreys pracující v laboratoři na univerzitě v anglickém Leicesteru povšiml zdánlivě nepatrných rozdílů v dědičné informaci různých členů rodiny jednoho laboranta. Tak se zrodila technika „otisku DNA“ neboli „DNA fingerprintu“. Do roku 1987, kdy byl celý postup komercionalizován, zůstával Jeffreys jediným člověkem na světě, který uměl „otisk DNA“ stanovit. Metoda našla široké uplatnění v kriminalistice a dnes s její pomocí usvědčuje násilníky a zloděje i plejáda detektivů v televizních seriálech. Už první případ, který Jeffreys rozlouskl s pomocí „DNA fingerprintu“, se však týkal důkazu rodičovství. Britští imigrační úředníci odmítli uvěřit tvrzení mladíka, že se vrací z návštěvy u příbuzných v Ghaně k rodičům, kteří dostali ve Velké Británii azyl. Cizinecká policie byla přesvědčená, že se s pasem mladíka snaží do země vloudit jeho vzdálený příbuzný. Jeffreys vyhověl žádosti mladíkovy matky a dokázal, že chlapec je její syn. Jsem biodetektiv, jmenuji se DNA a usvědčím každého! •Řešení trestních činů – shoda mezi podezřelým a stopou místa činu •Oběti neštěstí – havárie letadla, zemětřesení…. •Vojáci ve válce – kdo je „neznámý“ voják…. •Paternitní testování – kdo je otcem…. •Příbuzenské vztahy – nárok na dědictví…..…. •Hledání pohřešovaných osob – nález těla a identifikace •Vytváření databáze usvědčených zločinců Ve všech případech se určují DNA profily pomocí STR markerů a následně je hledána shoda s referenčním vzorkem Prof. Sir Alec Jeffreys Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) délka základní repetice 2 – 6 bp počet opakování repetice 2 – 100 bp Rozptýlené rovnoměrně v lidské genomu Vyskytují se běžně v populaci Nejsou přepisovány do proteinu leží v intronech Nejsou příčinou choroby Tvoří vzorce bez vztahu s fenotypem Mezi jednotlivci se velmi liší Odlišují jednoho člověka od druhého Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) STR - určení otcovství CODIS loci CODIS loci jsou DNA oblasti / znaky, které používá FBI a další světové agentury jako dohodnutý standard pro ukládání genetických profilů osob. Ve vyhodnocení paternitních testů se v současné době používá 16 oblastí DNA. Dnešní genetika ovšem během posledních let nabízí možnosti, o jakých se dřív ani nesnilo. Nejistý otec si bez problémů ověří, jestli vychovává svoje dítě a nejistá matka zjistí, který z tatínků je ten pravý, biologický. DNA je natolik variabilní, že každý člověk je de facto unikát a otcovství se tak dá potvrdit nebo vyvrátit s téměř stoprocentní pravděpodobností. Nakolik je celá tahle revoluce ve finále přínosná pro děti, je ovšem téma k další diskuzi. Vyspělé technologie umožňují molekulárním genetikům získat stále více informací o genetické výbavě analyzovaného člověka. Otázka je: Víme, jak s nimi naložit? Víme, jak je použít ve prospěch člověka? Sekvence naší DNA, vhodně zašifrovaná, se zanedlouho stane standardní součástí naší elektronické zdravotní dokumentace. Collins, F., (2010) The Language of Life. Profile Books LTD. London, GB. prof. RNDr. Jiřina Relichová, CSc. Lidská genetika ale ještě čeká na svoje hlavní slovo. Věřím, že 21. století bude stoletím genetiky člověka.