Příprava vzorků pro histologická vyšetření Josef Jaroš, Ph.D. Ústav histologie a embryologie LF MU Brno ➢ Biologický materiál ⚫ odběr, zpracování ➢ Příprava vzorku ⚫ fixace, zalévání, krájení ➢ Barvení ⚫ histologická, IHC, ISH Druhy biologického materiálu • K laboratorním vyšetřením se odebírají tělní tekutiny, tělesné sekrety, exkrety a tkáně Tělesné tekutiny Krev, mozkomišní mok, žaludeční a duodenální Tělesné sekrety Z chorobných ložisek, punktát, poševní sekret Tělesné exkrety Moč, stolice, pot, zvratky, sputum Tkáně orgánů Jater, ledvin, sliznice močového měchýře, žaludku, tkáně patologických útvarů – nádory; Tkáň ➢ Soubor morfologicky podobných buněk, které plní určitou funkci ➢ Buňky tvořící tkáň mohou být stejného typu, nebo jsou tkáně tvořené buňkami tvarově i funkčně rozdílnými Typy tkání • Epitelová (krycí) • Pojivová • Vazivo • Kost • Chrupavka • Svalová • Hladká • Příčně pruhovaná • Nervová • Neurony • Neuroglie • Tekutá (trofická) • Krev • Míza • Krvomíza krev kost Druhy vyšetření biologického materiálu • Histologická vyšetření • Vyšetřují se části tkání, e.g. kůže, svaly, pojivo, mízní uzliny etc. • Cytologická vyšetření • Vyšetřují se buňky získané ze sputa, kostní dřeně, apod. Druhy vyšetření biologického materiálu • Biochemická vyšetření • Určují obsah organických a anorganických látek materiálu – bílkoviny, tuky, glukóza, minerály, hormony, enzymy, vitamíny, léky • Ukazují, jaké metabolické a biochemické změny se v organismu dějí • Stanovují obsah a množství cizorodých látek v organismu Druhy vyšetření biologického materiálu • Mikrobiologická vyšetření • Bakteriologické, virologické, mykologické, parazitologické • Určují přítomnost patogenního původce – bakterie v krvi, v moči, ve sputu, v mozkomišním moku • Určují přítomnost parazita ve stolici a v krvi (nejčastěji roupy, škrkavky, tasemnice) Excize Punkce Kyretáž / Mikroabraze Stěr, nátěr Endoskopický odběr, laparoskopie Cytologické odběry Odběry materiálu NEKROPSIE Nekropsie = AUTOPSIE = PITVA Zkoumání chorobných změn v mrtvém těle a mikroskopické vyšetření vzorků tkání odebraných při pitvě. (řec. Necros – mrtvý, opsis – zrak) Nicolas Tulp 1632 Počátek 21. století BIOPTICKÉ VYŠETŘENÍ Diagnostická metoda odběru živé tkáně, nebo buněk. Navazuje na metody prebioptické (ultrazvuková diagnostika, endoskopie, aj.) a zpravidla je prováděna za kontroly vizuální (např. excize tkáně při operaci) (řec. bios – živý, opsis – zrak) ➢ Biopsie ➢ peroperační ➢ endoskopická ➢ cytologická ➢ Kožní excize ➢ Lymfatické uzliny ➢ Trepanobiopsie, Endoskopické biopsie, … Odběr embryonální tkáně Embryonální tkáň lze odebírat z různých vývojových stadií různými metodami. Volba metody závisí na typu tkáně a vývojovém stadiu embrya. ➢ Zygota ➢ Preimplantační embryo ➢ Postimplantační embryo ➢ Tkáň plodu ➢ Placenta ➢ Embryonální kmenové buňky ➢ Plodová voda Disekce, mikrodisekce, výplach, punkce Odběr embryonální tkáně důležité etické otázky použití tkání, u nichž nebyl dán souhlas a u nichž není známo, kdo je dárcem (například nevyzvednutá těla, archeologické tkáně a mumie). ➢ Mnoho sbírek lidských embryí a plodů. Staří, shromážděny před zavedením současných standardů informovaného souhlasu. ➢ O jedincích existuje jen malá nebo žádná dokumentace, včetně toho, zda byly získány legálně nebo eticky. ➢ Potřebná péče (výměna konzervačních prostředků, aktualizované označení). ➢ Podrobný historický výzkum, např. výzkum sbírky embryí na univerzitě v Göttingenu / Německo, která vznikla během druhé světové války. ➢ Otázky: Prozkoumat původ? Uložení? Zpopelnění? Centralizovaný program? FIXACE Princip fixace: Rychlá a šetrná denaturace/síťování proteinů, která zabrání autolýze. Požadavky na fixaci: Rychlá penetrace Zachování struktury tkání Zachování barvitelnosti tkání Podmínky ➢ Vzorky musí být přiměřeně velké – max. 1cm3 ➢ Objem fixativa ku vzorku min 20x ➢ Nesmí se vzorek lepit ke dnu ani plavat - přístup ➢ Vhodná nádoba ➢ Správně označit vzorek, žádanka na histologické vyšetření DRUHY FIXACE CHEMICKÁ - pro běžné účely - jemná a šetrná denaturace enzymů 1. Aldehydy (formaldehyd, glutaraldehyd) 2. Jiné organické látky (kyseliny, etylalkohol, metylalkohol, aceton) 3. Sloučeniny těžkých kovů (oxid osmičelý – EM) 4. Směsi – e.g. Davidsonova, Bouinova tekutina FYZIKÁLNÍ Ovlivňuje transportní funkci vody a tím naruší enzymaticky katalyzované reakce v buňkách 1. Působení nízké teploty – rychlé zmrazení 2. Lyofilizace a mrazová substituce (histochemie a imunohistochemie) – aceton+OsO4+GA 3. Fixace suchým teplem, fixace varem, mikrovlnka (rychlé zhotovení preparátů z biopsií) Formaldehyd – reverzibilní Glutaraldehyd – ireverzibilní Síťování proteinů Alkohol Kyseliny Zvýšená teplota Denaturace -> Vysrážení Ne - koagulační Koagulační Koagulace bilku Koagulace bilku Koagulace bilku Fixační prostředky – Formol ➢ Formalín (formol) - formaldehyd - paraformaldehyd (1859) nasycený roztok: 100% formol = 40% formaldehyd ➢ Nejpoužívanější, dostupný, relativně levný ➢ Rychle prostupuje tkání a uchovává strukturu ➢ Síťování epitopů dvojná vazba (GA – trojná) ➢ Nesmí “zmrznout” <8°C - polymerizace ➢ Tmavá láhev, oxidace – vede k produkci kys. mravenčí, proto stabilizace MeOH nebo pufr. Pracovní koncentrace nejčastěji 10% formol = 4% formaldehyd Proteiny a vazby Methylenové můstky Formalinový pigment Řešení pufrovaný formol Formol pH 3-4 vs pH tkání 7.6 - 7.8 Neutralizace - přidáním solí Krátká fixaceSprávná fixace Dlouhá fixace - Pigment na RBC (formalinovy hematin) Ledviny Etanol, aceton ➢ Rychlý prostup ➢ Nepoužívá u krvetvorných tkání – degradace ➢ Ne pro lipidy – rozpouští ➢ Smrstění ➢ Dehydratace, extrahují se tuky – zvýraznění komplexů granulárního endoplazmatického retikula ➢ Zejména v neurohistologii Nisslova substance – část nerv. tkáně ➢ Aceton (0-4°C) – enzymová histochemie, (e.g. amputace) Fyzikální – nativní tkáně ➢ Zmražení – tekutý vzduch, dusík-isopentan ⚫ rychlé, pomalé, proměnné – pokles 0,3-10 °C/min) ➢ Vitrifikace (1 500 -30 000°C/min) ⚫ Vysoké koncentrace kryoprotektiv, zejména v IVF ➢ kryoprotekce – ⚫ sacharóza (OCT, tissue-tek), DMSO, ethylenglykol Zmrazení živých tkání Pozitiva ➢ Nejrychlejší ze všech technik. ➢ Vynikající pro IHC, IF, ISH. Není třeba odkrývání antigenů, jelikož nedochází ke „kros-linkování“. ➢ Často snadno krájitelné – závisí na typu tkáně. (e.g.tuky, neuro) Negativa ➢ Náchylné k špatnému zachování morfologie. ➢ Mrazové artefakty – nezbytné okamžité a hluboké promražení ➢ ISH integrita – nutné pracovat v extrémně čistých podmínkách – degradace RNA. Vitrifikace Zřejmá krystalizace ledu Porušení struktury Při fixaci jde o Kompromis • v zachování morfologie, • stanovení proteinů, • histologickému barvení tkání, • či možnosti extrahovat RNA/DNA, tudíž volba fixativa a způsobu se vztahuje k požadovanému výsledku. Pro vznik velmi tenkých a kvalitních řezů je nutné tkáň zalít do média, které jí zpevní. Cílem je získat homogenní blok, který lze krájet na tenké řezy. Pro světelné mikroskopické pozorování řezy 5-10 μm Pro elektronmikroskopickou analýzu 50-100 nm. Zalévání tkání do médií ZALÉVÁNÍ TKÁNÍ 1. DO MÉDIÍ NEROZPUSTNÝCH VE VODĚ ➢ PARAFÍN - základní - nejrozšířenější použití ➢ PARAPLAST - zkvalitněný parafín při teplotě 58 °C ➢ Pryskyřice – elektron mikroskopie 2. DO MÉDIÍ ROZPUSTNÝCH VE VODĚ Želatina, agaroza,… Zalévání řídkých struktur – placenta, sliznice střeva, ad. Zalévání buněčných suspenzí, hydrogelů, obtížně uchopitelných vzorků Parafín - výhody, nevýhody, zalití ➢ Tenké řezy, které lze barvit všemi metodami ➢ Uchování na neomezenou dobu ➢ Možnost kdykoliv nakrájet další řezy ➢ Alkohol řada i zalití do parafinu ničí enzymy a způsobuje vyluhování tuků ➢ Odvodňováním může dojít ke smrštění tkáně a vzniku artefaktů ➢ Po prosycení – zalití parafinem do bloku MIKROTOMY Sáňkový mikrotom Reichert Rotační mikrotom Leitz Světelná mikroskopie 4-8 um MIKROTOMY Elektron mikroskopie řezy 50 nmSvětelná mikroskopie – řezy 5 um KRYOKAT Ultramikrotom HISTOLOGICKÉ BARVENÍ PROČ: Zobrazit buněčné struktury a/nebo chemickou povahu tkání HISTOLOGICKÉ BARVENÍ PRINCIP: Diferenciace jednotlivých buněk a tkání, jejich afinity k různým barvivům a zřetelné rozlišení ve světelném mikroskopu. ➢ Přehledná barvení – všeobecné informace o celém preparátu (HE, Van Gieson, Masson Trichromy) ➢ Specifické (selektivní) barvení – pro jednu určitou tkáňovou složku (Orcein, Alcian blue, Olejová červeň) TECHNOLOGIE BARVENÍ PRINCIP BARVENÍ Substrát Barvivo je barevná složka, která se váže na substrát. Chromogen Auxochrom ➢ Bazická – kladný náboj – barevný kationt se váže na aniont substrát, barví jaderný chromatin – např. hematoxylin, jádrová červeň ➢ Kyselá – záporný náboj - plazmatická – aniont na kationt substrát, barví cytoplazmu buněk – např. eosin ➢ Neutrální – pH 7, váže na bazo- i acidofilní struktury ➢ Amfoterická – v molekule kladné i záporné – reakce závisí na pH BARVIVA PODLE NÁBOJE Jádro Protein + -- -Protein Nukleová kyselina v jádře + - ➢ Bazická – kladný náboj – barevný kationt se váže na aniont substrát, barví jaderný chromatin – např. hematoxylin, jádrová červeň ➢ Kyselá – záporný náboj - plazmatická – aniont na kationt substrát, barví cytoplazmu buněk – např. eosin ➢ Neutrální – pH 7, váže na bazo- i acidofilní struktury ➢ Amfoterická – v molekule kladné i záporné – reakce závisí na pH BARVIVA PODLE NÁBOJE Jádro Protein + -- -Protein Nukleová kyselina v jádře + Kolagen Elektrostatická vazba Aniontová barva, kyselá Kationtová barva, zásaditá + - + +- +- BARVIVA PODLE PŮVODU ➢ PŘÍRODNÍ – extrakty rostlinného nebo živočišného původu (hematoxylin, orcein, šafrán, karmín) ➢ SYNTETICKÁ – umělá ( anilinová modř a všechna ostatní) Interakce mezi tkání a barvivem ➢ barvivo se rozpouští ve složce, absorbuje na povrch tkáň struktury, nebo dochází k precipitaci. ➢ (e.g. Tuky – Olejová červeň) FYZIKÁLNÍ PŘEHLEDNÉ BARVENÍ ZÁKLADNÍ METODA HEMATOXYLIN-EOSIN PRINCIP: ➢ zásaditým hematoxylinem vazba mezi DNA a RNA ➢ kyselým eosinem Y vazba k cytoplasmě ➢ ➢ Barvení H&E se používá k vizualizaci a analýze architektury a morfologie tkáně. MH HH WH WH Typy hlinitých hematoxylinů EOSIN – syntetizovaný z fluoresceinu – syntetický produkt. Užíváno v kosmetice EOSIN – syntetizovaný z fluoresceinu – syntetický produkt. • Kyselé (záporně nabité) “protibarvivo” k hematoxylinu • Váže se na amino kyseliny a většinu buněčných komponent (cytoplasma, ECM) • Barví rúžově Bromeosiny – žlutý, červený, nejčastěji 0,1- 0,5% vodný roztok Jódeosiny – stejné použití PŘEHLEDNÉ BARVENÍ HEMATOXYLINY Kamencové – rozpustné ve vodě – Mayerův HE, Heidenhein Železité – rozpustné v alkoholu – Weigert, Harris EOSINY Bromeosiny – žlutý, červený, nejčastěji 0,1-0,5% vodný roztok Jódeosiny – stejné použití VÝSLEDEK BARVENÍ: Jádra – modrofialová, cytoplazma – růžová POJIVOVÁ TKÁŇ POJIVOVÁ TKÁŇ VAZIVO – tkáň mezenchymového původu, tvořeno buňkami a mezibuněčnou hmotou. Jejím základem jsou vazivová vlákna a kyselé mukopolysacharidy. Vazivová vlákna rozlišujeme na: ➢ KOLAGENNÍ - jsou nejobjemnější složkou pojivových tkání. Jsou pevná, ohebná, ➢ ELASTICKÁ - se vyskytují společně s vlákny kolagenními, ale je jich mnohem méně. schopna protažení až na dvojnásobek své původní délky. ➢ RETIKULÁRNÍ – síť, složena z kolagenu typu III, v kostní dřeni a lymfatických orgánech. PŘEHLEDNÁ - VAZIVOVÁ VLÁKNA KOLAGENNÍ ➢ Massonovy trichromy – kolagen modrý, zelený a žlutý ➢ + Hematoxylin ➢ Van Gieson – kolagen červený Masson Trichrome - zelený Kolagen = barvivo s velkými molekulami Svalstvo - fuchsin ery = barvivo s malými molekulami Jádra = WH Masson Trichrome - modrý Kůže Kolagen – anilin blue Cytoplasma, ery jádra Masson Trichrome - žlutý Kůže Kolagen = šafrán Cytoplasma, ery jádra Van Gieson Žaludek Kolagen Svaly, erytrocyty jádra Kys pikrová Kys fuchsin SELEKTIVNÍ BARVENÍ V preparátu se značí pouze některé struktury. Přehled o přítomnosti retikulárních či elastických vláken, určit přítomnost kyselých mukopolysacharidů nebo glykogenu. Resorcinfuchsin - modročerný Orcein - hnědočervený Aldehydfuchsin fialový aorta VAZIVOVÁ VLÁKNA ELASTICKÁ Resorcin-Fuchsin Weigertův HE Van Gieson duodenum Elastin aorta Zajišťují pružnost. Pro vývoj několika orgánů např. plíce, cévy a kůže. jemné spletité sítě, ve VŠECH orgánech. obklopuje bb, hladkou i příčně pruh. svalovinu, tvoří síť pod epitelem, je součást bazálních membrán., je to trámčina lymfatických a krvetvorných tkání VAZIVOVÁ VLÁKNA RETIKULÁRNÍ https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/special-stains-which-one-how-and-why- part-ii-connective-tissue/ Průkaz: impregnačními metodami (Gömöri, Jones) Princip: ➢ Impregnace solemi těžkých kovů (AgNO3) ➢ Polysacharidy na ret vláknech redukují soli stříbra Výsledek: retikulin černý (retikulin = kolagen III) VAZIVOVÁ VLÁKNA RETIKULÁRNÍ Gömöri Alciánová modř - mukopolysacharidy. Značení chrupavky a vývoje kostí PAS - karbohydráty a glykoproteiny. Značení jater a pankreatu v embryologii Olejová červeň Tuky. Značení tukové tkáně Průkazy anorganických iontů a sloučenin Katalytická histochemie – enzymatická aktivita HISTOCHEMIE https://link.springer.com/protocol/10.1007/978- 1-62703-989-5_9 Alciánová modř, Alizarin red Myš E14.5, 16.5 IMUNOHISTOCHEMIE Princip: detekce specifických antigenních molekul (nebo jejích částí) s využitím imunologické vazby ANTIGEN-PROTILÁTKA IMUNOHISTOCHEMIE • Protilátky se váží k antigenu vysoce specificky • Poskytuje informaci o lokalizaci v „prostoru“ tkáně • Lze využít k lokalizaci konkrétních buněk či proteinů • Lze použít k detekci některých buněčných procesů – e.g. dělení, apoptóza Které buněčné části lze „cílit“ • Jádro • Cytoplasma • Buněčná membrána • Extracelulární matrix • Proteiny • Sacharidy http://www.abcam.com/ab76020.html http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/galleries/static/cells/ https://www.mybiosource.com/PLIN2-ADFP-Adipophilin/ Buněčné události - detekce • Buněčné dělení • Signalizující buňky • Apoptóza • Struktura cytoskeletu https://www.google.cz/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&ved=0ahUKEwjXo9O5uYTQAhVLJMAKHduhD08QFggxMAE&url=https%3A%2F%2Fwww.sigmaald rich.com%2Fcontent%2Fdam%2Fsigma- aldrich%2Fdocs%2FSigma%2FGeneral_Information%2Fnormalimmunoranges.pdf&usg=AFQjCNG3Q9ISlU0SHnpny6nD5QvFnVOZCQ&cad=rja Ki-67 TF Vim-aTubAnnexin V/Cytochrome C Značky k vizualizaci protilátek • Světelná • ENZYMY • AVIDIN-BIOTINOVÝ KOMPLEX • Fluorescenční • FLUOROCHROMY • Autoradiografie http://www.augusta.edu/mcg/pathology/research/ Human lymph node Dual AP/HRP Možnosti u protilátek – které ovlivňují výsledek ▪ Monoklonální vs polyklonální ▪ Tvořená proti celé molekule, N-konec, Ckonec, specifické aminokyseliny ▪ Ascites, supernatant, serum Monoklonální Ascites 0,5- 5 mg/ml (nejvyšší afinita) Supernatant z bun. kultury 0,01-0,05 mg/ml Polyklonální- (nejnižší afin/avid) Myš 2-5 Potkan 5-7 Králík 12-14,5 Koza 18-24 Kráva 9-24 Kůň 11-21 Ovce 18-24 Prase 17-24 Člověk 7,5-22 Ascites - Hybridomové buňky rostoucí v peritonealní kavitě myši (potkana) – množení a produkce tekutiny AscitesSerum,plasma Supernatant Monoklonální vs. polyklonální Monoklonální • Myš nebo králík hybridom • Jsou „čistější“ • Velmi konzistetní batch-to-batch • Spíše vychází falešně negativní Polyklonální • Více rozdílných druhů • Nespecifická reaktivita • Rozdílná afinita batch-to-batch • Úspěšnější při neověřených aplikací Ujistěte se, že máte protilátky specifické pro danou aplikaci IF = imunofluorescence ICC = imunocytochemie IHC-Fr = imunohistochemie ze zmražené tkáně (cryocut) IHC-P = imunohistochemie z parafinového bloku WB, IP apod. Cytoskelet Dvojité značení IF: BCL6 and Ki-67 (MIB 1) Zdroj: Alexa Fluor Značky – fluorochromy Substrát DiAminoBenzidin Postup při ImunoHistoChemickém značení tkáně Fixace Zalití - Parafin - Deparafin Krájení Odkrývání antigenů Permeabilizace Blokovani Postup při IHC značení tkáně Fixace Zalití - Parafin - Deparafin Krájení Odkrývání antigenů Permeabilizace Blokovani Prim protilátka Oplach Sekundar Oplach Značení jader DAPI/Hoechst Postup při IHC značení tkáně Fixace Zalití - Parafin - Deparafin Krájení Odkrývání antigenů Permeabilizace Blokovani Prim protilátka Oplach Sekundar Oplach Značení jader DAPI/Hoechst Montáž Mikroskopie Postup při IHC značení tkáně IMUNOHISTOCHEMIE - metody • PŘÍMÁ – reakce antigen + značená primární protilátka • NEPŘÍMÁ • DVOJSTUPŇOVÉ – reakce antigen + primární protilátka + značená sekundární protilátka – vyšší citlivost reakce • TROJSTUPŇOVÉ - sekundární protilátka značená biotinem na sebe váže avidin nebo avidinbiotinový komplex (ABC). Vícebarevné značení Značka fluorescenční Značka enzymy DAB a AP IN SITU HYBRIDIZACE Molekulárně cytogenetická metoda k lokalizaci a identifikaci specifické sekvence nukleotidů v DNA, popř. RNA Postup: • Příprava materiálu (chromozomy v metafázi, buňky) • Denaturace sondy a cílové DNA • Hybridizace sondy a cílové DNA • Odstranění nespecifických signálů • Fluorescenční barvení jader Diagnostika - HPV, jadra, cytokeratin Genetika FISH = fluorescence in situ hybridization - Aplikace