Koagulace - principy testů
- teoretická část výuky 2023
6.4,2023 - 3 hod (12.00 - 14.50 hod, přednášky)
povinné pro absolventy Bc z jiných fakult než LF MU!
^ principy vyšetření hemostázy, preanalýza ^ kalibrace a kontroly v koagulační laboratoři
13.4.2023 - 2 hod (7.00 - 8.50 hod, cvičení)
^ základní koagulační testy
^ rutinní a globální koagulační testy
^ interpretace výsledků
20.4.2023 - 2 hod (7.00 - 8.50 hod, cvičení)
^ speciální koagulační testy I
27.4.2023 - 2 hod (7.00 - 8.50 hod, cvičení)
^ speciální koagulační testy II
Koagulace - cvičení
- praktická část výuky 2023
-» 13.4.2023-2 hod (9,00-10.50 hod)
Skupina 1
Kalibrace a praktické provedení základních koagulačních vyšetření - Protokol č.1 Skupina 2
• Interpretace výsledků rutinních koagulačních testů - Protokol č.2
• Monitorování antitrombotické léčby - Protokol č.4 Skupina 3
• Vyšetření agregace trombocytů - Protokol č.3
20.4.2023-2 hod (9,00-10.50 hod)
Skupina 1
• Vyšetření agregace trombocytů - Protokol č.3 Skupina 2
Kalibrace a praktické provedení základních koagulačních vyšetření - Protokol č.1 Skupina 3
• Interpretace výsledků rutinních koagulačních testů - Protokol č.2
• Monitorování antitrombotické léčby - Protokol č.4
27.4.2023-2 hod (9,00-10.50 hod)
Skupina 1
• Interpretace výsledků rutinních koagulačních testů - Protokol č.2
• Monitorování antitrombotické léčby - Protokol č.4 Skupina 2
• Vyšetření agregace trombocytů - Protokol č.3 Skupina 3
• Kalibrace a praktické provedení základních koagulačních vyšetření - Protokol č.1
Zápočet - koagulace
Podmínky zápočtu účast praktika ^ odevzdání protokolů 1,2,3,4
Praktická zkouška koagulace
Kalibrace rutinních a speciálních koagulačních vyšetření - kalibrační křivka, odečet
Interpretace výsledků koagulačních testů
^1 PT, APTT, Fbg, TT, AT, D-Di
Zkušební otázka z laboratorní hematologie
Principy vyšetření hemostázy, preanalýza
Jiřina Zavřelové
Dělení testů dle principu
■^Koagulační Fotometrické Imunochemické
Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické)
Sledování času rozpuštění koagula Sledování rozpustnosti koagula Jiné
Dělení testů dle principu
Koagulační
sledování času srážení (srážlivá plná krev)
• bez přídavku aktivátoru/aktivovaná doba srážení (ACT)
• manuálně (kývání)
• POCT (přenosné přístroje point-of-care)
sledování času vytvoření fibrinového vlákna
• manuálně (háčkování)
• koagulometr (poloautomat, automat)
• mechanické
• kuličkové (sledování změn pohybu kuličky)
• optické
• nefelometrie (sledování rozptylu světla)
• turbidimetrie (sledování průchodnosti světla)
Doba srážení- manuální metoda
POCT -ACT (HEMOCHRON)
Odkápnutí krve do testovací jamky jednorázové kyvety s reagencií (aktivátor) a vložení do pokusné komory
Pohyb vzorku po smíchání vzorku s reagencií v pokusném kanálku předurčenou rychlostí
Začátek tvorby koagula je detegován na základě zpomalení toku vzorku v pokusném kanálku mezi optickými detektory LED
Mechanické koagulometry Stago
Měření odchylky oscilační amplitudy kuličky
Při stálé vizkozitě - stálé kyvadlové houpání kuličky díky dvěma zahnutým kolejničkám na dně kyvet a elektromagnetickému poli vytvářenému na obou stranách (cívky)
Zmenšení amplitudy - nárůst vizkozity - jev koagulace. Na základě změny amplitudy se stanovuje koagulační čas.
Mechanický koagulometry Benk
Sledování změny frekvence (f) průchodu rotující kuličky v kyvetě pomocí optického senzoru
Optické koagulometry
Detekce koagulačního času
Procentuální detekce ^1 Derivace křivky ^1 Vyhodnocení počáteční rychlosti
Procentuální detekce
Intenzita rozptýleného světla po přidání reagencie před začátkem procesu koagulace je definována jako 0%
Intenzita rozptýleného světla po ukončení procesu koagulace s maximálním zákalem jako 100%
Koagulační čas pak odpovídá procentuálně definované intenzitě rozptýleného světla z koagulační křivky (např. 50 %)
Intenzita rozptýleného světla
i
100%
I
50%
Změna v intenzitě rozptýleného světla
0%
I
Rozdíl a derivace
50%
Počáteční rychlost
Dělení testů dle principu
Fotometrické - kolorimetrické
sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A)
• end point" (A)
• kinetické (AA/min)
limitace -hemolytické a ikterické vzorky
^Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) sledování změn zakalení
• detekce změn transmise (propustnosti T) limitace- chylózní vzorky
Kolorimetrické testy
Chromogenní substrát
^ uměle připravený
velkoobjemová aminokyselinové koncovka      raménko zakončené
Argininem
bezbarvý paranitroanilid
Kolorimetrické testy
Princip
^ enzymy štěpí substrát ^ měříme při 405 nm
- vzniká žluté zbarvení
paranitroanilin
Dělení testů dle principu
Imunochemické
sledování reakce antigénu s protilátkou
• aglutinace
• LIA
• ELISA
• EID
Aglutinační metody
sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu
odečítání makroskopicky ^ pozitivní( +, ++, +++)/negativní semikvantitativní metody (udaná mez detekce)
metody
latexaglutinačni (např. FDP, D-Di) hemaglutinační (např. FM)
Příklad vyšetření D-Dimerů
Mez detekce = 0,5 mg/l	neředěný vzorek	vzorek ředěný 1:6	výsledek
aglutinace			< 0,5 mg/l
aglutinace	+		> 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l
aglutinace	+	+	> 3,0 mg/l
Liquid immunoassay - LIA metody
Sledování aglutinace mikrolatexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu
Odečítání optickým systémem koagulometru
Změna zakalení (AA/min) při 540 nm Kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag...)
^ kalibrační křivka - polynom 3.řádu (vícebodová)
Limitace
Chylozita vzorku
^1 Hookův jev (vysycení protilátky antigenem)
ELISA metody
-^Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní metody
inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab
odsátí vzorku + promytí
inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag
^ odsátí AbE a promytí
detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A)
• přímá úměra: enzym, aktivita x množství Ag
Elektroimunodifúze - EID metody
vyšetřovaný antigén reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku
■Adélka píku je přímo úměrná koncentraci antigénu
kvantitativní metoda
Princip EID
kalibrace      vzorky pacientů
Vyšetření plazmatických proteinů
Vyšetření funkční aktivity koagulační metody fotometrické metody
Vyšetření antigénu
imunochemické metody
Odlišení defektů kvalitativních kvantitativních
Správnost laboratorních výsledků
Faktory objektivní subjektivní
Faktory ^ preanalytické analytické postanalytické
Preanalytické faktory
Příprava pacienta Odběr vzorku Transport vzorku Zpracování vzorku Skladování vzorku
Příprava pacienta
Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků Dostatečný příjem tekutin Uvedení času odběru Uvedení léčby
Uvedení komplikace při odběru
Odběr vzorku
Minimální zatažení paže
->Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek
První 2-3 ml nelze použít
-^Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev-citrát sodný v ředění 1:10
Šetrné promíchání krve s citrátem (5-1 Ox)
Antikoagulancia
Citrát sodný
0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno a 1,129 mol/l (3,8%)
-»CTAD zkumavky
brání aktivaci trombocytů ^ doporučeno pro testy PAI-1, heparin,
Správný odběr vzorku
Vyřadit vzorky Sražené
->S chybným objemem krve (rozdíl 10%)
méně krve
• prodloužení koagulačních časů
• APTT citlivé od 90 % objemu
• PT citlivé od 80 % objemu
více krve
• zkrácení koagulačních časů??
Správný odběr vzorku
Hemolytické, ikterické a chylózní
hemolytický a ikterický vzorek
• ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení
• při výrazné hemolýze i koagulační stanovení
• aktivace krevního srážení uvolněním TF
chylózní vzorek
• ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech
• a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky
Správný odběr vzorku
Hematokrit 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu
100 - hematokrit
ml citrátu = ------------------x ml plné krve
595 - hematokrit
Transport vzorku
->Čas (max 2 hod) * Teplota (18-25°C) Mechanické vlivy (potrubní pošta)
Zpracování vzorku
Odstranění krevních buněk centrifugací Stažení plazmy
Většina testů do 1 - 4 hod po odběru
* Výjimka EGT, EF (15 - 30 min), heparin, PAI-1, LA, vyšetření funkcí trombocytů
Vyšetřovaný materiál
Plazma
^ plazma bohatá na trombocyty
• centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace ^ plazma chudá na trombocyty
• centrifugace 15 minut 2500 g ^ bezdestičková plazma
• dvojnásobná centrifugace (filtrace, ultracentrifugace ne)
Plná krev Sérum
Centrifugace
Výpočet otáček pro danou centrifugu *g = 1,118x10-5xrxN2
r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min Příklad:
r = 15 cm, 2500g     3860 otáček/min
Skladování primárních vzorků
* Laboratorní teplota 18 - 25 °C a PT 6 hodin
APTT 4 hodiny ^ APTT (léčba heparinem) 1 hodinu ^ Ostatní vyšetření: 4 hod
Vyšší teplota ne
Uložení v lednici (aktivace FF VII a XII) ne
Zamrázování vzorků
Plazma chudá na destičky/bezdestičková ^ Objem > 500 ul Zkumavka se zátkou Správná velikost zkumavky
naplněná do 3/4 Rychlé zamrazení (-70 °C, -196 °C) Skladování zamrazených vzorků ^1 krátkodobé -20 °C, dlouhodobé: - 70 °C
Rozmrazování vzorků
Při 37 °C min 5 minut Dobře promíchat
Opakované zamrazení není možné!
Analytické faktory
Dodržování metodických postupů
Správné pracovní návyky
Správná funkce a kalibrace přístrojů
Výběr diagnostických setů a reagencií
Správná volba kalibračních a kontrolních materiálů
Správně provedená kalibrace a kontroly kvality
Postanalytické faktory
Rozmezí fyziologických hodnot Terapeutické rozmezí Vyjadřování výsledků Vyhodnocení výsledků Interpretace výsledků