Mgr. Jolana Lipková, Ph.D. Genetika v zubním lékařství – cvičení 1 Základní pojmy •Genetika •obor zabývající dědičností a variabilitou kvantitativních a kvalitativních znaků všech živých organismů • •Gen •základní jednotka dědičnosti (genetické informace) •konkrétní úsek molekuly DNA, který nese informaci pro tvorbu bílkoviny nebo nukleové kyseliny •skládá se z exonů a intronů – strukturní – funkční • • • • •Chromozom •funkční celek dědičného záznamu genetické informace v buňce •jádro buňky 22 párů autozomů + 1 pár gonozomů – •Lokus •umístění genu na určitém místě na konkrétním chromozomu • •Alela •konkrétní forma genu • • • Základní pojmy •Genomika •obor genetiky, který se snaží stanovit úplnou genetickou informaci organismu a interpretovat ji v termínech životních pochodů – •Heterozygot •dvě různé varianty (alely) daného genu nebo jeho části – •Homozygot •dvě stejné varianty (alely) daného genu nebo jeho části • • • Základní pojmy •Polymorfismus • existence několika (přinejmenším dvou) alel pro daný gen, z nichž nejméně častá má populační frekvenci alespoň ≥ 1% • •Mutace • procesy, při kterých dochází ke změnám v genotypu v důsledku působení různých faktorů prostředí • méně častá alela má populační frekvencí < 1% Základní pojmy •molekula DNA = kyselina deoxyribonukleová –Dvoušroubovice – 2 řetězce v opačném směru –Polynukleotidový řetězec •Dusíkatá báze ( T, A, C, G) spojená vodíkovými můstky •Zbytek kyseliny fosforečné •Cukerná složka – deoxyribóza • •molekula RNA = kyselina ribonukleová –jednovláknová –Polynukleotidový řetězec •Dusíkatá báze ( U, A, C, G) spojená vodíkovými můstky •Zbytek kyseliny fosforečné •Cukerná složka –ribóza –Typy – mRNA, tRNA, rRNA • DNA vs. RNA Ústřední dogma molekulární biologie •= tvorba kopií molekul DNA zajišťující přenos genetické informace • z mateřské do dceřiné buňky • •S-fáze buněčného cyklu •semikonzervativní proces – 1 nové + 1 staré vlákno • •Složky potřebné pro replikaci •templát – mateřské vlákno •primer – krátký oligonukleotid s volným 3´OH koncem •enzymy •nukleotidy • • Replikace DNA •Vznik replikační vidlice •helikáza – umožňuje oddálit obě molekuly dvojšroubovice •SSB proteiny – napomáhají udržet vlákna rozdělená •DNA primáza – tvorba RNA primerů • •Replikace je zahájena ve specifických místech – počátcích replikace („origins“) • •DNA polymeráza – katalyzuje prodlužování řetězce •sekvence nového vlákna dle principu komplemetarity bází - adenin + thymin (2 vodíkové můstky) a cytosin + guanin (3 vodíkové můstky) •syntéza od 5´ konce ke 3´ konci • Replikace DNA •Templátová vlákna antiparalelní – jeden řetězec opožděn •Vedoucí řetězec – jeden RNA primer na začátku, replikace probíhá bez přerušení •Opožďující se řetězec – ve směru 5´- 3´ se diskontinuitně tvoří krátké Okazakiho fragmenty (každý z nového RNA primeru), které se následně spojí DNA ligáza •RNA primery jsou odstraněny 5´-3´exonukleázovou a nahrazeny 3´-5´polymerázovou aktivitou Replikace DNA •přepis informace v podobě sekvence DNA do sekvence RNA •jádro buňky •templát - vlákno DNA •Transkripty se z templátu uvolňují jako jednořetězce •DNA-dependentní RNA polymeráza •3 typy (strukturně podobné, přepisují různé typy genů) •RNA pol. I (geny kódující rRNA) •RNA pol. II (geny kódující hnRNA) •RNA pol. III (geny kódující tRNA) •vyžaduje přítomnost transkripčních faktorů (rozvolnění řetězců DNA, umístění RNA polymerázy. na promotor a uvolnění z promotoru) •Promotor = startovací místo na DNA – TATA box, CAT box •Terminátor = koncové místo - AAAA • • Transkripce •Modifikace primárních transkriptů: •Připojení čepičky na 5´konec (podílí se na řízení translace mRNA) • • • • •Připojení polyadenylačního řetězce na 3´konec •Sestřih (splicing) RNA – vystřižení intronů za vzniku zralé mRNA outline_of_splicing_c_la_739 Posttranskripční modifikace •Překlad genetické informace z mRNA do sekvence AMK v polypeptidu (pomocí genetického kódu) •Probíhá na ribozomy v cytoplazmě buňky • – •Fáze – iniciace, elongace, terminace •Enzym - Aminoacyl-tRNA syntetáza •Iniciační komplex se tvoří na 5´konci mRNA (čepička), zkoumá mRNA od 5´konce a hledá iniciační kodon AUG •Terminace translace: UAA, UAG, UGA •Postranslační úpravy – fosforylace, glykosylace, metylace, …. Translace •Systém, podle kterého se přiřazují specifické AMK do polypeptidového řetězce podle sekvence mRNA •Triplet = kodon – definuje AMK nebo terminaci translace •Každá AMK určena jedním nebo několika kodony v mRNA •64 možných tripletů: 61 určuje AMK, 3 určují terminaci translace •Kodony jsou rozeznávány komplementárními sekvencemi v tRNA (antikodony), které nesou na 3´konci specifické AMK •Inzerce/delece jednoho/dvou párů bází mění čtecí rámec •(Téměř) univerzální, degenerovaný • Genetický kód Genetický kód – změna čtecího rámce • •= uspořádaný sled procesů, při kterých buňka zdvojí svůj obsah a následně se rozdělí na dvě buňky dceřiné (každá z nich ponese stejné chromozomy) • •Cíl: reprodukce genetického materiálu pro příští generaci buněk • •Jednobuněčné organismy •sladěno s růstem – mateřská b. musí dorůst do určité velikosti, aby se rozdělila • •Mnohobuněčné organismy •sladění replikace DNA s vývojovým programem buňky •sladění replikace a dělení každé buňky s vývojem příslušné tkáně nebo orgánu •dospělost - buňky se dělí, když je potřeba (nahrazení odumírajících buněk, obnova poraněné tkáně) •ztráta kontroly nad buněčným cyklem -> rakovina • E:\PREDNASK\obr6.jpg Buněčný cyklus –Interfáze – G1, G2, S (90%) •příprava na buněčné dělení, vnější jaderná membrána je spojená s ER •nepříznivé podmínky •setrvání v G1/vstup do G0; buňky nerostou, mohou tak setrvat i několik měsíců/let fig11_03 Buněčný cyklus •G0-fáze •většina buněk mnohobuněčných organismů (jsou diferencované a specializované k výkonu určité funkce, nedělí se) •po přijetí prorůstového faktoru mohou vstoupit zpět do buněčného cyklu •G1-fáze •nejdelší a nejvariabilnější •buňka se zvětšuje a zdvojuje organely •na konci této fáze se nachází kontrolní bod: bod restrikce •buňka má dostatek živin a růstových faktorů, vykazuje vysokou metabolickou aktivitu -> přejde bod restrikce a pokračuje do další fáze •nedostatek živin, obdržení antiproliferačního signálu -> zpomalení postupu fází/opuštění cyklu (přechod do G0) – •G2-fáze •dvojnásobné množství DNA (než v G1) •syntéza proteinů potřebných na vstup do mitózy •S-fáze •replikace DNA •syntéza proteinů asociovaných s DNA M fáze (mitotická) •mitóza x meióza •jaderné dělení, kondenzace chromozomů – až 10 000× •karyokineze a cytokineze •klesá syntéza RNA a proteinů • • •kladeny vysoké nároky na přesnost •bezchybná replikace •správné řazení fází •mitóza před dokončením replikace -> ztráta genetické informace min. u jedné buňky •dvojnásobná replikace před mitózou -> zvýšený počet kopií genů na příslušné části chromozomu -> nerovnováha v genové expresi, nízká viabilita •přesná segregace chromozomů •koordinace s vývojovými programy • – kontrolní body SouvisejÃcà obrázek Buněčný cyklus •řídící elementy – cyklin dependentní kinasy •řídí aktivitu mnoha proteinů zapojených do replikace DNA a mitózy tím, že je ve specifických místech fosforylují (aktivace/inaktivace) – •Cyklin + CDK -> komplex se připojí na protein -> fosforylace proteinu -> po fosforylaci se komplex – rozpadne a dojde ke změně aktivity proteinu Buněčný cyklus •DNA •RNA •PROTEIN Biologický materiál Metody molekulární biologie Reverzní transkripce – Wikipedie https://www.kangaservices.gr/images/kanga/arthra/bio-uliko.jpg •Detekce přítomnosti nukleové kyseliny specifické sekvence •Identifikace živočišného druhu •Paternita •Identifikace jedince - forenzní účely •Profil DNA – SNPs •Analýza struktury (sekvence) nukleové kyseliny •Stanovení genotypu •Detekce klinicky významných mutací a polymorfismů •Dědičné choroby •Detekce v onkogenech a supresorových genech v nádorech •Prenatální, preimplantační diagnostika •Kvantifikace nukleové kyseliny se specifickou sekvencí •Hodnocení intenzity a změny exprese genů – tumory •Kvantifikace proteinů a typů jejich posttranslační modifikace DNA diagnostika •Biologický materiál je vše, co bylo či je součástí nebo produktem živého organismu –sušená bylinná čajová směs –ohryzek od jablka –dubové prkno –kočičí trus/srst –zkumavka s virem SARS-CoV-2 –tělní tekutiny – moč, krev, plazma, sérum, sliny, ejakulát, hlen –tkáně, buňky Biologický materiál Práce s biologickým materiálem PLNÁ KREV - PLAZMA, SÉRUM ,SLINY, BUŇKY, TKÁNĚ, TĚLNÍ TEKUTINY • • Izolace DNA, RNA, PROTEINY Detekce a Kvantifikace • DNA Detekce polymorfismu a mutace 1. PCR (amplifikace konkrétního fragmentu)- RFLP (naštěpení spec. restrikčními enzymy) – detekce na ELFO 2. Real-Time PCR 3. Sekvenace Klonování v plasmidech Zásah do genové exprese Epigenenom metylace DNA histonové modifikace 1. RNA - mRNA Analýza genové exprese Nothern Blott Real-Time PCR Analýza transkriptomu MicroRNA PROTEIN Analýza proteinů Imunohistochemické metody 1. Western Blott 2. ELISA Analýza proteomu MS Analýza buněk Průtoková flow-cytometrie •V nativním stavu z přirozeného materiálu – v dostatečném množství a požadované čistotě. •NK je potřeba zbavit všech všech látek,které se po lyzi buněk stávají součástí hrubého lyzátu a jejichž přítomnost by bránila účinnému specifickému působení enzymů používaných k dalším analýzám • •Izolace genomové DNA •Izolace RNA – důraz na ochranu před degradací • •Stanovení koncentrace a čistoty DNA/RNA • – Spektrofotometrie •Kontrola kvality a integrity - ELFO Izolace nukleových kyselin Extract Reagent (Genomic DNA Isolation Reagent) | GeneDireX, Inc. Addgene: Kit Free RNA Extraction •Amplifikace vybraného úseku DNA •Mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce - řetězová reakce • vychází z DNA replikace • •Kary Mullis, 1983 •DNA řetězce duplexu může být denaturována a znovu spojena • •DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů • - separace řetězců • - syntéza krátkých RNA primerů • - syntéza dvou nových DNA helixů •DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym • (1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA Polymerázy) • •AŽ S OBJEVEM A POUŽITÍM TERMOSTABILNÍ POLYMERÁZY •(TERMOFILNÍ BAKTERIE) ZÍSKALA PCR NA VÝZNAMU •FUNKCE OSTATNÍCH PROTEINŮ JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT ! • • • PCR – Polymerase chain reaction •Cíl – získání požadované a specifické sekvence genomové DNA •Princip – mnohonásobná replikace •cca 30 cyklů •závislost na teplotě reakční směsi •množství namnožené DNA roste exponenciální řadou (2n) • •komponenty PCR: •- templátová DNA •- dNTP •- pufr (pH=8) •- Mg2+ ionty (aktivita a přesnost polymerázy) •- Primer - krátké specifické úseky DNA, •oligonukleotid 20–25 pb, ohraničení oblasti amplifikace DNA •- DNA polymeráza •termostabilní (odolává teplotám až 98 °C) •Taq (Thermus aquaticus), Tth (Thermus thermophilus) •- teplota •opakování cyklů: • - denaturace (separace dsDNA) • - navázání primerů • - elongace primerů • - syntéza nového vlákna DNA • pomocí změn teploty! Praktická část cvičení Stanovení SNP +3953C/T (rs1143634) v genu pro interleukin IL-1beta u pacientů s chronickou peridontitidou • • CO? •cytokiny X onemocnění parodontu PROČ? Zánětlivé onemocněnění parodontu - komplexní onemocnění (endogenní a exogenní faktory) 1.Příčina zánětu-mikrobiální plak (anaerobní bakterie) – začátek imunitní odpovědi 2. Individuální predispozice 1. RIZIKOVÉ A PROTEKTIVNÍ ALELY IL-1beta – prozánětlivý cytokin – rizikové alely (Kornman, 1997) Práce z biologickým materiálem (PLNÁ KREV, PLAZMA, SÉRUM) • • • Izolace DNA • METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE JAK? 1.Amplifikace DNA úseku - PCR 2.Detekce polymorfního místa - Restrikční analýza 3. Vizualizace - Elektroforéza 1.PCR IL-1B +3953C/T (rs1143634) u subjektů s chronickou peridontitidou • •CCTTCTGATT TTATACCTAA ACAACATGTG CTCCACATTTCAGAACCTAT CTTCTTCGAC ACATGGGATA ACGAGGCTTA TGTGCACGAT • • • JAK? 249bp Forward Reverse amplifikace vybraného úseku z celkové DNA 1.RFLP IL-1B +3953C/T (rs1143634) pomocí restrikční endonukleázy TaqI • • • • •CCTTCTGATT TTATACCTAA ACAACATGTG CTCCACATTTCAGAACCTAT CTTCTTCGAC ACATGGGATA ACGAGGCTTA TGTGCACGAT • • • JAK? 249bp Forward Reverse 114bp 135bp C detekce úseku s konkrétní variantou C/T 1.ELFO restrikčních fragmentů po štěpení TaqI (Agarózový gel) • •1. Neštěpená TT • •2. Štěpená CC • • •3. Heterozygot CT – 3 pruhy • JAK? 249bp 114bp 135bp C vizualizace DNA fragmentů po restrikční analýze 1.Praktické provedení PCR PCR Objem v mikrozkumavce: 25ųL Složení (1 vzorek): •templátová DNA (2ųL) •2 primery (1.25 ųL) •MgCl2 25mM (4 ųL) •dNTP mix (0.5 ųL) •Taq polymeráza 1U (1 ųL) •pufr (2.5 ųL) •PCR H2O (12.5 ųL) 1 kapka minerálního oleje 1.95°C…..5minut 2.95°C…..1 minuta 3.60°C…..1minuta 4.72°C…..1minuta 5.72°C…..7minut 6.10°C…..10minut 35x Práce s mikropipetou •Pipetu držím vždy vertikálně (špičkou dolů). • •Pipetu držím v dlani zavěšenou za ukazováček a ovládám ji palcem. • •Vyberu optimální rozsah objemu!!! Nikdy nepřekračuju rozsah pipety nahoru ani dolů!!! •Před pipetováním musíme na pipetu nasadit příslušnou špičku (dle objemového rozsahu pipety). • •Vždy používám novou sterilní špičku. • •Pokud opakovaně pipetuju tentýž roztok, ponechám na pipetě po celou dobu práce tutéž špičku. • •K odhazování špiček slouží tlačítko na boční straně pipety. • • • Práce s mikropipetou Postup: •Na pipetě nastavím požadovaný objem. Vodorovná čára na displeji značí desetinnou čárku. •Nasadím špičku na pipetu (důkladně utěsním) – ne rukama! • •Pipetu uchopím tak, abych si o ukazováček podepřel/a držák a palcem tak mohl/a pracovat s dvoupolohovým ovladačem. • •Nasátí: ovladač stlačím do polohy „1“ (špička je ve vzduchu), ponořím do roztoku a pomalu pustím. • •Vypuštění: pipetu ponořím do roztoku, kam chci pipetovanou látku přidat. Vypustím roztok stlačením ovladače do polohy „1“, dokončím stlačením do polohy „2“ a vyjmutím špičky z roztoku (stále v poloze „2“). • •Ovladač pustím, špičku vyhodím. Obsah obrázku držení, interiér, osoba, zeď Popis byl vytvořen automaticky • Life of a molecular biologist | Biology humor, Science jokes, Science memes