Mgr. Jolana Lipková, Ph.D. Genetika v zubním lékařství – cvičení 2 Metody molekulární biologie Práce s biologickým materiálem PLNÁ KREV - PLAZMA, SÉRUM ,SLINY, BUŇKY, TKÁNĚ, TĚLNÍ TEKUTINY • • Izolace DNA, RNA, PROTEINY Detekce a Kvantifikace • DNA Genotypování detekce polymorfismu/ mutace •PCR (amplifikace konkrétního fragmentu)+ RFLP (naštěpení spec. restrikčními enzymy) – detekce na ELFO •Real-Time PCR •Sekvenace 1. Metody molekulární biologie •Genotyp: -konkrétní kombinace dědičných vloh -genetická konstituce organismu/jedince -soubor všech genů v konkrétních alelách, které má organismus k dispozici • pro zajištění svých biochemických, fyziologických a morfologických znaků -soubor alel specificky uspořádaných v genomu - všechny molekuly DNA • + soubor epigenetických faktorů • •Genotyp (v užším pojetí): •- dvojice alel téhož genu (maternální x paternální) – genetický polymorfismus -gen pro fenylalaninhydroxylasu : 2 alelní formy: dominantní A a recesivní a • - 3 genotypy - AA (dominantní homozygoti), Aa (heterozygoti) a aa (recesivní homozygoti) -vícealelní systémy- krevní skupiny ABO- tří alely - 6 genotypů • např. HLA lokus - vysoká variabilita genotypů (více než 60 alel) - sada HLA genů na jednom • chromosomu tvoří haplotyp ( jedinec- dva - v každém 5 determinantů) – vazba genů (↓ rekombinace) – • -genetický marker při populačních výzkumech, určování otcovství. - • genotyp určuje rozsah, míru fenotypových možností svého nositele • genotypy jedinců téhož druhu mají odlišné genomické sekvence ( genových x mimogenové oblasti) • • • •Genotypování - proces determinace genetických variant - buňka, organismus a/nebo jedinec • PCR-polymerázová řetězová reakce , RFLP-analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů, sekvenování, DNA čipy…… •Sekvenace - metoda sloužící k určení konkrétní sekvence určité délky Genotyp, Genotypování ogeny opočet kopií genů (rRNA geny) nebo menších či větších oblastí genomu (CNV – copy number variation) opolymorfismy v sekvenci nukleotidů (SNP, indel – insertion or deletion) ovariabilita v délce repetitivních sekvencí 20 alel pro HLA – A, 40 alel pro HLA – B, 8 a více pro zbylé tři). Všechny geny I. třídy leží v jedné oblasti, geny II. třídy zase v jiné oblasti komplexu, jejich pořadí ve směru od centroméry je II → III → I. Mezi značným počtem genů jsou i pseudogeny. Pro každý z genů I. a II. třídy existuje mnohotná alelie. Alelní formy molekul MHC se liší ve struktuře vazebného místa a tím i schopností vázat peptidy. Polymorfismus zde představuje selekční výhodu související se základní rolí molekul MHC, tj. prezentace antigenu. •Genetická variabilita vs Genetická diverzita • •Genetická variabilita - v populacích, když se vyskytuje více než jedna alela v lokusu – čím variabilnější – rychleji se vyvíjí a lépe přežívá •Genetická diverzita – různost mezi organismy (genet. fixovaná) –nutná podmínka života •Vznik nových alel – mutací (spontánní x indukovaná) četnost menší než alely původní •Polymorfismus x fixace alely •Alely s nulovým nebo negativním vlivem na fitness - minimální šance na zachování v dostatečně velké panmiktické populaci •Výjimka - změna okolních podmínek změní vliv jednotlivých alel na fitness -vymizení nově nevýhodných alel); v malých populacích - větší šance, fixace -genetický drift nebo efekt hrdla lahve •Nové alely se ve větších populacích časem zafixují, pokud se jim podaří přestát první období, kdy je jich velmi málo a kdy jim hrozí vymizení z důvodu prosté smůly. • •U různých populací téhož druhu mohou být různé poměry zastoupení mezi jednotlivými alelami. •U malých oddělených populací nebo kdy je vliv alely na vnější znaky u různých populací různý - výskyt alely pro srpkovitou anemii. Genetická variabilita Z 381 párů: 38 geneticky identických 39 více než 100 změn DNA každého jedince se vyznačuje několika polymorfismy, které jej odlišují od zbytku populace. Bylo zjištěno, že některé SNP jsou zodpovědné za geneticky podmíněné nemoci a proto má jejich objevování a studium působení velký význam v medicíně. Jednonukleotidové polymorfismy mají význam také v zemědělství. Jsou často spojeny s různými užitečnými vlastnostmi plodin jako je např. odolnost vůči různým patogenním organismům. •Polymorfní znaky: barva očí, vlasů, kůže, ABO •Monomorfní znaky: jedna alela je fixovaná, všichni jedinci exprimují stejný fenotyp pro daný znak (jsou homozygoti) •Mezi > 20,000 genes: nejvíce polymorfní: beta haemoglobin (HBB)- 176 SNVs per kilobase (kb) • •single nucleotide polymorphisms (SNPs) •small-scale insertions/deletions •polymorphic repetitive elements •microsatellite variation • •SNP (Single nucleotide polymorphism) - polymorfizmus jediného nukleotidu); představuje nejčastější formu polymorfizmu v lidském genomu, vyskytující se asi jedenkrát na 1000 bází, •HUGO, 2000 - 1.5 milionu SNP, dnes 9 milionů •SNP se vyskytují v nekódujících oblastech častěji •SNV- jednonukleotidová varianta -změna v jediném nukleotidu nezávisle na frekvenci výskytu v populaci a tyto varianty mohou vzniknout v somatických buňkách. Somatické jednonukleotidové varianty (např. mutace související s rakovinou), mohou být také nazývány "single-nucleotide alterations". •Většina genů - 4 SNVs per kilobase, ~ 97% genů má alespoň 1 SNV, 149 genů-bez SNV nebo INDEL.15 Genetický polymorfismus, SNP (modrá barva očí-několik polymorfismů –méně melaninu) Human skin color is influenced by an intergenic DNA polymorphism regulating transcription of the nearby BNC2 pigmentation gene. • Mutation and polymorphism are two terms used to describe DNA variants Mutation refers to a DNA variant in a particular individual •Polymorphism refers to DNA variants within a population. • •The main difference between mutation and polymorphism: •Mutation is a change in a DNA sequence of the genome of a particular organism •Polymorphism is a mutation that occurs in more than 1% of a particular population (minor allele frequency of a particular allele in the population is more than 1%) • •Mutation is an alteration of the nucleotide sequence of a gene. If a mutation occurs in a population with a frequency of more than 1%, the mutation is called a polymorphism. • polymorfismus vs mutace •PCR •Real-time PCR •Restrikční analýza •Sekvenování • • Metody molekulární biologie Manipulace s NK Extrakce, Izolace a purifikace Detekce a kvantifikace •spektrofotometrie •gelová alektroforéza Amplifikace •klonování DNA molekul v plasmidech (restrikční enzymy) •polymerasová řetězová reakce = PCR Přepis mRNA do cDNA (complementary DNA) - reverzní transkriptáza Sekvenace – celogenomové studie (DNA čipy - cDNA microarrays ) Analytické metody detekce změn (mutace, polymorfismy) v DNA, genotypování •Amplifikace +RFLP •Real-time PCR •Sekvenace •DNA čipy - cDNA microarrays • Analytické metody detekce exprese genů a studium transkripce Detekce hladin mRNA (exprese) • Real-Time PCR •DNA čipy - cDNA microarrays Studium interakce DNA-protein (protein-protein) -analýza vazby transkripčních faktorů Detekce stavu modifikace chromatinu (pozice nukleozomů, stav acetylace histonu – v oblasti promotoru) •mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce •“klonování” bez bakterií, ve zkumavce •řetězová reakce vycházející z DNA replikace •opakování cyklů: –denaturace (separace dsDNA) – 96 °C –annealing – navázání primerů – 50–65 °C –elongace – syntéza nového vlákna DNA – 72 °C • • • PCR •Polymerázová řetězová reakce sledovaná v reálném čase •Kvantifikace DNA – množství DNA je zaznamenáváno v průběhu každého cyklu •Množství produktu, vytvořeného amplifikací, závisí v každé PCR na množství templátové DNA, která je přidána do reakce. Reakce tedy probíhá tzv. kvantitativně. •Detekce množství DNA je umožněna přítomností fluorescenčního substrátu •Provádí se ve speciálním cycleru, který umožňuje: –Cyklické střídání teplot –Detekci fluorescence –Monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR produkty elektroforeticky • •qPCR se obvykle provádí v 96 jamkových destičkách, úroveň fluorescence je zaznamenávaná v jednotlivých jamkách •Vysoce citlivá a vysoce specifická metoda • • • qPCR – Kvantitativní PCR Real-time PCR •Intenzita fluorescence je přímo úměrná množství produktu, který v reakci vzniká qPCR •Detekce produktu: • 1.interkalační barviva – Sybr GREEN – nespecificky se váže na dsDNA 2. sekvenčně specifická sonda – krátký oligonukleotid s barvičkou a zhášečem (TaqMan) – po jeho rozpadu při syntéze DNA nárůst fluorescenčního signálu (využívá 5´-3´ exonukleázovou aktivitu DNA polymerázy) Video pro názornost: https://youtu.be/YhXj5Yy4ksQ Využití: kvantifikace genové exprese kvantifikace patogenů genotypizace Monogenní onemocnění *Detection of Thalassemia, hemophilia, Sickle cell anemia & favism *Cystic fibrosis *Phenylketonuria Forenzní medicína Prenatální daignostika *Noninvasive Prenatal Diagnosis by Analysis of Fetal DNA in Maternal Plasma. Virologie Diagnostika patogenů *Quantitatively measurment of Human Immunodeficiency Virus (HIV). *Detection and Quantitation of Circulating Plasmodium falciparum DNA. *Effect of antimicrobial peptides on host cells Figure 1. Examples of specific molecular beacon fluorescence increase during real-time PCR in samples containing single lymphoblasts homozygous normal for CF (green), heterozygous DF508 (blue), or homozygous DF508 (red). (A) Fluorescent signal from the molecular beacon detecting the normal allele. (B) Fluorescent signal from the molecular beacon detecting the DF508 allele. Dashed lines indicate the threshold of 200 units (~10 SD above baseline readings) used for determining CT values. Cystic fibrosis qPCR v Diagnostice •Restrikční endonukleáza • (Meselson and Yuan 1968, Smith • and Wilcox 1970) •sekvenčně specifické endonukleázy (původ z bakterií) •EcoRI (Escherichia coli), HindIII (Haemophilus influenzae) •tupé/lepivé konce •funkce: •rozpoznání specifické sekvence dsDNA a následná restrikce (hydrolýza fosfodiesterových vazeb) •rozpoznávací místo •4–8 bp dlouhé •charakter palindromu = stejné pořadí bází v obou směrech • Restrikční enzymy •tvorba rekombinantních DNA •přečnívající kompatibilní konce usnadňují spojení různých fragmentů DNA •hormon Protropin® (Genentech, 1985) •interferon α Roferon A® (Hoffmann-La Roche, 1986) •první rekombinantní vakcína proti hepatitidě B Recombivax® exprimovaná v kvasince Saccharomyces cerevisiae (Merck, 1986) •první přípavek založený na monoklonální protilátce Orthoclone OKT 3 (Janssen-Ortho, 1986)(Cvak a Fusek, 2004). •2006 - registrováno 1452 biotechnologických firem v USA •tetravalentní vakcína proti lidskému papilomaviru (HPV) s názvem Gargasil, Silgard , 2006 • •tvorba GMO •bakterie mění DNA (Agrobakterie) rostliny, aby ta dělala, co ony potřebují •1986, schválena první první transgenní rostliny – tabáku nesoucího vložený gen pro rezistenci k herbicidu. Environmental Protection Agency,c USA •70 % dnes pěstované bavlny je geneticky modifikovaných Restrikční endonukleázy •Enzymatické štěpení DNA ve specifickém restrikčním místě •Restrikční endonukleázy •Produktem jsou fragmenty o různé délce •Vzniklé fragmenty jsou separovány pomocí gelové elektroforézy • •Využití: –mapování DNA, analýza modifikací DNA, příprava mutantů –na základě velikosti a počtu fragmentů lze sledovat rozdíly ve studovaných sekvencích, tzv. polymorfizmy (polymorfizmy vznikají přestavbou v řetězci, např. inzercí, delecí, substitucí bází) –příbuznost jedinců, určení paternity, identifikace osob – –Neštěpená TT –Štěpená CC –Heterozygot CT RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis - Jarcho - 1994 - Current Protocols in Human Genetics - Wiley Online Library •Separační metoda využívaná při izolaci a analýze NK (a proteinů = polyakrylamidová elfo) •Izolující molekuly o rozdílné hmotnosti, popř. odlišném elektrickém náboji, využívající jejich odlišnou pohyblivost v elektrickém poli •agarózová (produkt mořských řas – agar)/polyakrylamidová • Gely tvoří hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji • než menší molekuly –technika molekulového síta •Rychlost pohybu je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku •DNA má uniformní negativní náboj v elektrickém poli se pohybuje od katody k anodě • •EtBr – vmezeří se mezi báze, zviditelní DNA pod UV • (po vazbě na DNA pod UV emituje oranžové světlo) • •Velikost fragmentu DNA lze stanovit dle hmotnostních standardů • (= restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, • jejichž velikost byla stanovena sekvenováním) • •Části aparatury: elektroforetická vana, separační gel, pufr, zdroj stejnosměrného elektrického proudu • • • • • • • Gelová elektroforéza - agarózová https://ars.els-cdn.com/content/image/3-s2.0-B9780444636881000070-f07-01-9780444636881.jpg?_ (B) Ideální vzorek DNA (C) Částečně degradovaná DNA (D) Degradovaná DNA (E) DNA kontaminovaná RNA (degradovaná) (F) DNA kontaminovaná proteinem (A) Trans2K™ Plus DNA Marker (0,1 kb- 5 kb) (B) Ideální vzorek RNA (C) RNA kontaminovaná DNA a proteinem (D) Degradovaná RNA (E) RNA kontaminovaná gDNA *Ribosomální RNA migruje v agarózovém gelu rychleji než stejně velký fragment DNA, a proto při použití DNA žebříčku nelze určit skutečnou velikost 28/18/5S rRNA •Stanovení primární struktury DNA (pořadí nukleotidů) • •a) chemická metoda – dříve; degradace řetězců nukleových kyselin pomocí chemických činidel (dimethylsulfát, NaOH, hydrazin,..) – Maxam-Gilbertova metoda •b) enzymatická metoda – specifická inhibice enzymové syntézy DNA (ddNTP) – Sangerova metoda •c) moderní velkoformátové aplikace založené např. na pyrosekvenování (sekvenování nové generace) • •Produkt – řetězce ssDNA, jejichž vzájemná velikost se liší o jednu bázi (elfo rozdělení) • •Vstupní materiál – fragment DNA s přesně definovanými konci Sekvenace DNA •Sekvence je odvozena z molekuly DNA, která se chemicky degraduje na fragmenty v místech, kde se vyskytuje báze určitého typu. Ty se následně separují pomocí elfo. •Chemická činidla – příklad: –piperidin narušuje glykosidovou vazbu A a G (A + G) –hydrazin za přítomnosti NaCl reaguje pouze s C –NaOH při 90 °C způsobuje silné štěpení u A a slabé štěpení u C (A > C) •Vyžaduje radioaktivní značení na jednom konci ssDNA. •Reakce je prováděna ve 4 zkumavkách – v každé zkumavce jsou štěpeny pouze určité typy bazí. •Vzniká směs různě dlouhých fragmentů končících v místě určité báze –> vyhodnocení pomocí elfo, stanovena sekvence daného úseku. Maxam-Gilbertovo sekvenování Schematic illustration of sequencing with the Maxam Gilbert method. | Download Scientific Diagram Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=_B5Dj8PL4E0 Sangerovo sekvenování •Enzymová metoda •Založeno na principu replikace – ukončení syntézy DNA v okamžiku, kdy se ddNTP zařadí na místo dNTP •ddNTP = analog dNTP, ale postrádá hydroxylovou skupinu na 3´ pozici uhlíku •ddNTP – koncové terminátory •Reakční směs (4x) •DNA templát •primer •ddNTP – v nízké koncentraci •dNTP – v nadbytku (aby bylo možné získat fragmenty všech možných délek) •Taq DNA polymeráza - syntéze DNA od 5´ ke 3´ konci •pufr •Vyhodnocení – elektroforéza •Modifikace –> fluorescenčně značené ddNTP (4 různé barevné značky) – reakce provedena v jedné zkumavce Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=wdS3j0TgbjM Deoxy versus dideoxy dideoxy Sangerovo sekvenování • Kapilární sekvenace DNA s fluorescenčně značenými ddNTP NGS – Next Generation Sequencing •Sekvenování tisíců až milionů sekvencí současně •Templátová DNA je fragmentována na úseky několik set bp dlouhé •Konce fragmentů jsou enzymaticky zatupeny a napojeny k oligont určité sekvence (= adaptéry) •Jednotlivé fragmenty jsou odděleně amplifikovány PCR a v dalším kroku paralelně sekvenovány • •Využití: –celogenomové sekvenování –sekvenování chromozomů, plazmidů, mt –studium genetické variability, mutační analýza –transkriptomová analýza What is Next Generation Sequencing NGS? - Enzo Life Sciences Next-Generation Sequencing Challenges Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=shoje_9IYWc Praktická část cvičení Stanovení interleukinu IL-1beta +3953C/T (rs1143634) u pacientů s chronickou peridontitidou • • CO? •cytokiny x onemocnění parodontu PROČ? Zánětlivé onemocněnění parodontu - komplexní onemocnění (endogenní a exogenní faktory) 1.Příčina zánětu-mikrobiální plak (anaerobní bakterie) – začátek imunitní odpovědi 2. Individuální predispozice 1. RIZIKOVÉ A PROTEKTIVNÍ ALELY IL-1beta – prozánětlivý cytokin – rizikové alely (Kornman, 1997) Práce z biologickým materiálem (PLNÁ KREV, PLAZMA, SÉRUM) • • • Izolace DNA • METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE JAK? 1.Amplifikace DNA úseku - PCR 2.Detekce polymorfního místa - Restrikční analýza 3. Vizualizace - Elektroforéza 1.PCR IL-1B +3953C/T (rs1143634) u subjektů s chronickou peridontitidou • •CCTTCTGATT TTATACCTAA ACAACATGTG CTCCACATTTCAGAACCTAT CTTCTTCGAC ACATGGGATA ACGAGGCTTA TGTGCACGAT • • • JAK? 249bp Forward Reverse amplifikace vybraného úseku z celkové DNA 1.RFLP IL-1B +3953C/T (rs1143634) pomocí restrikční endonukleázy TaqI • • • • •CCTTCTGATT TTATACCTAA ACAACATGTG CTCCACATTTCAGAACCTAT CTTCTTCGAC ACATGGGATA ACGAGGCTTA TGTGCACGAT • • • JAK? 249bp Forward Reverse 114bp 135bp C detekce úseku s konkrétní variantou C/T 1.ELFO restrikčních fragmentů po štěpení TaqI (Agarózový gel) • •1. Neštěpená TT • •2. Štěpená CC • • •3. Heterozygot CT – 3 pruhy • JAK? 249bp 114bp 135bp C vizualizace DNA fragmentů po restrikční analýze ELFO – praktické provedení •1. Připravit nalévací misku + hřebínky. •2. Připravit gel (2%): navážit agarózu a přenést do Erlenmayerovy baňky, přidat 1x TBE pufr (200 ml). •3. Zvážit a v mikrovlnce přivést k varu. •4. Po zchladnutí na cca 40 °C přidat EtBr (1 ul / 10 ml). •5. Nechat gel ztuhnout (cca 30 min). •6. Odstranit hřebínky a gel vložit do elektroforetické vany s 1x TBE pufrem (elektrolyt). • •7. Připravit kapky nanášecí barvy na parafínový papír a smíchat s vzorky DNA. •8. Vzorky nanést do jamek. •9. Zapojit do zdroje elektrického napětí. •10. Sledovat postup DNA gelem (20min). • •11. Vizualizace pod UV a vyhodnocení. Práce s mikropipetou •Pipetu držím vždy vertikálně (špičkou dolů). • •Pipetu držím v dlani zavěšenou za ukazováček a ovládám ji palcem. • •Vyberu optimální rozsah objemu!!! Nikdy nepřekračuju rozsah pipety nahoru ani dolů!!! •Před pipetováním musíme na pipetu nasadit příslušnou špičku (dle objemového rozsahu pipety). • •Vždy používám novou sterilní špičku. • •Pokud opakovaně pipetuju tentýž roztok, ponechám na pipetě po celou dobu práce tutéž špičku. • •K odhazování špiček slouží tlačítko na boční straně pipety. • • • Práce s mikropipetou Postup: •Na pipetě nastavím požadovaný objem. Vodorovná čára na displeji značí desetinnou čárku. •Nasadím špičku na pipetu (důkladně utěsním) – ne rukama! • •Pipetu uchopím tak, abych si o ukazováček podepřel/a držák a palcem tak mohl/a pracovat s dvoupolohovým ovladačem. • •Nasátí: ovladač stlačím do polohy „1“ (špička je ve vzduchu), ponořím do roztoku a pomalu pustím. • •Vypuštění: pipetu ponořím do roztoku, kam chci pipetovanou látku přidat. Vypustím roztok stlačením ovladače do polohy „1“, dokončím stlačením do polohy „2“ a vyjmutím špičky z roztoku (stále v poloze „2“). • •Ovladač pustím, špičku vyhodím. Obsah obrázku držení, interiér, osoba, zeď Popis byl vytvořen automaticky