Metody molekulární biologie Mgr. Jolana Lipková, PhD •Biologický materiál je vše, co bylo či je součástí nebo produktem živého organismu –sušená bylinná čajová směs –ohryzek od jablka –dubové prkno –kočičí trus/srst –zkumavka s virem SARS-CoV-2 –tělní tekutiny – moč, krev, plazma, sérum, sliny, ejakulát, hlen –tkáně, buňky Biologický materiál https://www.kangaservices.gr/images/kanga/arthra/bio-uliko.jpg Práce s biologickým materiálem PLNÁ KREV - PLAZMA, SÉRUM ,SLINY, BUŇKY, TKÁNĚ, TĚLNÍ TEKUTINY • • Izolace DNA, RNA, PROTEINY Detekce a Kvantifikace • DNA Detekce polymorfismu a mutace 1. PCR (amplifikace konkrétního fragmentu)- RFLP (naštěpení spec. restrikčními enzymy) – detekce na ELFO 2. Real-Time PCR 3.Sekvenace Analýza sekvence DNA Klonování Zásah do genové exprese Epigenenom metylace DNA histonové modifikace 1. RNA - mRNA Analýza genové exprese Nothern Blott Real-Time PCR Analýza transkriptomu MicroRNA PROTEIN Analýza proteinů Imunohistochemické metody 1. Western Blott 2. ELISA Analýza proteomu MS Analýza buněk Průtoková flow-cytometrie •V nativním stavu z přirozeného materiálu – v dostatečném množství a požadované čistotě. •NK je potřeba zbavit všech všech látek,které se po lyzi buněk stávají součástí hrubého lyzátu a jejichž přítomnost by bránila účinnému specifickému působení enzymů používaných k dalším analýzám • •Izolace genomové DNA •Izolace RNA – důraz na ochranu před degradací • •Stanovení koncentrace a čistoty DNA/RNA • – Spektrofotometrie •Kontrola kvality a integrity - ELFO Izolace nukleových kyselin Extract Reagent (Genomic DNA Isolation Reagent) | GeneDireX, Inc. Addgene: Kit Free RNA Extraction •Separační metoda využívaná při izolaci a analýze NK (a proteinů = polyakrylamidová elfo) •Izolující molekuly o rozdílné hmotnosti, popř. odlišném elektrickém náboji, využívající jejich odlišnou pohyblivost v elektrickém poli •agarózová (produkt mořských řas – agar)/polyakrylamidová • Gely tvoří hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji • než menší molekuly –technika molekulového síta •Rychlost pohybu je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku •DNA má uniformní negativní náboj v elektrickém poli se pohybuje od katody k anodě • •EtBr – vmezeří se mezi báze, zviditelní DNA pod UV • (po vazbě na DNA pod UV emituje oranžové světlo) • •Velikost fragmentu DNA lze stanovit dle hmotnostních standardů • (= restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, • jejichž velikost byla stanovena sekvenováním) • •Části aparatury: elektroforetická vana, separační gel, pufr, zdroj stejnosměrného elektrického proudu • • • • • • • Gelová elektroforéza - agarózová https://ars.els-cdn.com/content/image/3-s2.0-B9780444636881000070-f07-01-9780444636881.jpg?_ (B) Ideální vzorek DNA (C) Částečně degradovaná DNA (D) Degradovaná DNA (E) DNA kontaminovaná RNA (degradovaná) (F) DNA kontaminovaná proteinem (A) Trans2K™ Plus DNA Marker (0,1 kb- 5 kb) (B) Ideální vzorek RNA (C) RNA kontaminovaná DNA a proteinem (D) Degradovaná RNA (E) RNA kontaminovaná gDNA *Ribosomální RNA migruje v agarózovém gelu rychleji než stejně velký fragment DNA, a proto při použití DNA žebříčku nelze určit skutečnou velikost 28/18/5S rRNA •Amplifikace vybraného úseku DNA •Mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce • - řetězová reakce vychází z DNA replikace • •Kary Mullis, 1983 •DNA řetězce duplexu může být • denaturována a znovu spojena • •DNA replikace in vivo vyžaduje • několik enzymů • - separace řetězců • - syntéza krátkých RNA primerů • - syntéza dvou nových DNA helixů •DNA replikace in vitro vyžaduje pouze • jeden enzym (1957 Arthur Kornberg • dokázal existenci DNA Polymerázy) • • FUNKCE OSTATNÍCH PROTEINŮ JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT ! • PCR – Polymerase chain reaction •komponenty PCR: •templátová DNA •dNTP •pufr (pH=8) •Mg2+ ionty (aktivita a přesnost polymerázy) •Primer - krátké specifické úseky DNA, •oligonukleotid 20–25 pb, ohraničení oblasti amplifikace DNA •DNA polymeráza •termostabilní (odolává teplotám až 98 °C) •Taq (Thermus aquaticus), Tth (Thermus thermophilus) •teplota • • • • • •opakování cyklů: • - denaturace (separace dsDNA) • - navázání primerů • - elongace primerů • - syntéza nového vlákna DNA • • pomocí změn teploty! • • • • •až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERÁZY •(termofilní bakterie) získala PCR na významu •Polymerázová řetězová reakce sledovaná v reálném čase •Kvantifikace DNA – množství DNA je zaznamenáváno v průběhu každého cyklu •Detekce množství DNA je umožněna přítomností fluorescenčního substrátu •Provádí se ve speciálním cycleru, který umožňuje: –Cyklické střídání teplot –Detekci fluorescence –Monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR produkty elektroforeticky • •qPCR se obvykle provádí v 96 jamkových destičkách, úroveň fluorescence je zaznamenávaná v jednotlivých jamkách •Vysoce citlivá a vysoce specifická metoda • • • qPCR – Kvantitativní Real-time PCR •Intenzita fluorescence je přímo úměrná množství produktu, který v reakci vzniká qPCR •Detekce produktu: • •interkalační barviva – Sybr GREEN – nespecificky se váže na dsDNA •sekvenčně specifická sonda – krátký oligonukleotid s barvičkou a zhášečem (TaqMan) – po jeho rozpadu při syntéze DNA nárůst fluorescenčního signálu (využívá 5´-3´ exonukleázovou aktivitu DNA polymerázy) Video pro názornost: https://youtu.be/YhXj5Yy4ksQ Využití: kvantifikace genové exprese kvantifikace patogenů genotypizace Monogenní onemocnění *Detection of Thalassemia, hemophilia, Sickle cell anemia & favism *Cystic fibrosis *Phenylketonuria Forenzní medicína Prenatální daignostika *Noninvasive Prenatal Diagnosis by Analysis of Fetal DNA in Maternal Plasma. Virologie Diagnostika patogenů *Quantitatively measurment of Human Immunodeficiency Virus (HIV). *Detection and Quantitation of Circulating Plasmodium falciparum DNA. *Effect of antimicrobial peptides on host cells Figure 1. Examples of specific molecular beacon fluorescence increase during real-time PCR in samples containing single lymphoblasts homozygous normal for CF (green), heterozygous DF508 (blue), or homozygous DF508 (red). (A) Fluorescent signal from the molecular beacon detecting the normal allele. (B) Fluorescent signal from the molecular beacon detecting the DF508 allele. Dashed lines indicate the threshold of 200 units (~10 SD above baseline readings) used for determining CT values. Cystic fibrosis qPCR v Diagnostice •Restrikční endonukleáza • (Meselson and Yuan 1968, Smith • and Wilcox 1970) •sekvenčně specifické endonukleázy (původ z bakterií) •EcoRI (Escherichia coli), HindIII (Haemophilus influenzae) •tupé/lepivé konce •funkce: •rozpoznání specifické sekvence dsDNA a následná restrikce (hydrolýza fosfodiesterových vazeb) •rozpoznávací místo •4–8 bp dlouhé •charakter palindromu = stejné pořadí bází v obou směrech • Restrikční enzymy •Enzymatické štěpení DNA ve specifickém restrikčním místě •Restrikční endonukleázy •Produktem jsou fragmenty o různé délce •Vzniklé fragmenty jsou separovány pomocí gelové elektroforézy • •Využití: –mapování DNA, analýza modifikací DNA, příprava mutantů –na základě velikosti a počtu fragmentů lze sledovat rozdíly ve studovaných sekvencích, tzv. polymorfizmy (polymorfizmy vznikají přestavbou v řetězci, např. inzercí, delecí, substitucí bází) –příbuznost jedinců, určení paternity, identifikace osob – –Neštěpená TT –Štěpená CC –Heterozygot CT RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis - Jarcho - 1994 - Current Protocols in Human Genetics - Wiley Online Library •tvorba rekombinantních DNA •přečnívající kompatibilní konce usnadňují spojení různých fragmentů DNA •hormon Protropin® (Genentech, 1985) •interferon α Roferon A® (Hoffmann-La Roche, 1986) •první rekombinantní vakcína proti hepatitidě B Recombivax® exprimovaná v kvasince Saccharomyces cerevisiae (Merck, 1986) •první přípavek založený na monoklonální protilátce Orthoclone OKT 3 (Janssen-Ortho, 1986)(Cvak a Fusek, 2004). •2006 - registrováno 1452 biotechnologických firem v USA •tetravalentní vakcína proti lidskému papilomaviru (HPV) s názvem Gargasil, Silgard , 2006 • •tvorba GMO •bakterie mění DNA (Agrobakterie) rostliny, aby ta dělala, co ony potřebují •1986, schválena první první transgenní rostliny – tabáku nesoucího vložený gen pro rezistenci k herbicidu. Environmental Protection Agency,c USA •70 % dnes pěstované bavlny je geneticky modifikovaných Restrikční endonukleázy •Stanovení primární struktury DNA (pořadí nukleotidů) • •a) chemická metoda – dříve; degradace řetězců nukleových kyselin pomocí chemických činidel (dimethylsulfát, NaOH, hydrazin,..) – Maxam-Gilbertova metoda •b) enzymatická metoda – specifická inhibice enzymové syntézy DNA (ddNTP) – Sangerova metoda •c) moderní velkoformátové aplikace založené např. na pyrosekvenování (sekvenování nové generace) • •Produkt – řetězce ssDNA, jejichž vzájemná velikost se liší o jednu bázi (elfo rozdělení) • •Vstupní materiál – fragment DNA s přesně definovanými konci • Sekvenace DNA •Sekvence je odvozena z molekuly DNA, která se chemicky degraduje na fragmenty v místech, kde se vyskytuje báze určitého typu. Ty se následně separují pomocí elfo. •Chemická činidla – příklad: –piperidin narušuje glykosidovou vazbu A a G (A + G) –hydrazin za přítomnosti NaCl reaguje pouze s C –NaOH při 90 °C způsobuje silné štěpení u A a slabé štěpení u C (A > C) •Vyžaduje radioaktivní značení na jednom konci ssDNA. •Reakce je prováděna ve 4 zkumavkách – v každé zkumavce jsou štěpeny pouze určité typy bazí. •Vzniká směs různě dlouhých fragmentů končících v místě určité báze –> vyhodnocení pomocí elfo, stanovena sekvence daného úseku. Maxam-Gilbertovo sekvenování Schematic illustration of sequencing with the Maxam Gilbert method. | Download Scientific Diagram Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=_B5Dj8PL4E0 Sangerovo sekvenování •Enzymová metoda •Založeno na principu replikace – ukončení syntézy DNA v okamžiku, kdy se ddNTP zařadí na místo dNTP •ddNTP = analog dNTP, ale postrádá hydroxylovou skupinu na 3´ pozici uhlíku •ddNTP – koncové terminátory •Reakční směs (4x) •DNA templát •primer •ddNTP – v nízké koncentraci •dNTP – v nadbytku (aby bylo možné získat fragmenty všech možných délek) •Taq DNA polymeráza - syntéze DNA od 5´ ke 3´ konci •pufr •Vyhodnocení – elektroforéza •Modifikace –> fluorescenčně značené ddNTP (4 různé barevné značky) – reakce provedena v jedné zkumavce Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=wdS3j0TgbjM Sangerovo sekvenování • Kapilární sekvenace DNA s fluorescenčně značenými ddNTP NGS – Next Generation Sequencing •Sekvenování tisíců až milionů sekvencí současně •Templátová DNA je fragmentována na úseky několik set bp dlouhé •Konce fragmentů jsou enzymaticky zatupeny a napojeny k oligont určité sekvence (= adaptéry) •Jednotlivé fragmenty jsou odděleně amplifikovány PCR a v dalším kroku paralelně sekvenovány • •Využití: –celogenomové sekvenování (evoluční biol.) –sekvenování chromozomů, plazmidů, mt –studium genetické variability, mutační analýza –transkriptomová analýza –antropologie: srovnávání DNA k zjišťování migrací lidských ras (zejména podle mitochondriální DNA a Y-chromozomální DNA) What is Next Generation Sequencing NGS? - Enzo Life Sciences Next-Generation Sequencing Challenges Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=shoje_9IYWc • PCR Protocol : r/funny