Alergologické vyšetření
Mgr. Julie Štíchová
MUDr. Zita Chovancová, Ph.D
ÚKIA - FNUSA
Obor: Bioanalytik, jaro 2021
Alergie
„Alergická onemocnění jsou způsobena nepřiměřenou reakcí imunitního systému na běžné
neškodné antigeny pocházející z vnějšího prostředí.“
Tyto antigeny se nazývají alergeny.
Typy přecitlivělosti dle Coombse a Gella
1. I. Typ přecitlivělosti s účastí IgE – atopická
2. II. Typ - reakce s účastí IgG a IgM
Podtyp IIa - cytotoxická reakce – potransfuzní reakce, hemolytické onemocnění novorozence
Podtyp IIb – blokující a stimulující autoprotilátky (myasthenia gravis, thyreotoxikóza)
3. III. Typ – imunokomplexová reakce – sérová nemoc, SLE
4. IV. Typ – reakce oddálené přecitlivělosti
o S převažující účastí Th1 + makrofágy  granulom (TBC, sarkoidóza)
o S Th1 s převažujícími (Th17) a CD8 cytotoxickými T-lymfocyty  kontaktní dermatitida
5. Reakce na cizí těleso
6. Septický šok
Přecitlivělost I. Typu
Probíhá ve 3 fázích:
1. fáze senzibilizace
•zpracování alergenu,
indukce Th2 odpovědi  produkce IgE
•Vazba IgE na vysokoafinitní Fcε receptory žírných
buněk
2. Časná fáze alergické reakce (minuty po styku)
•Aktivace žírných buněk alergenem  degranulace
3. Pozdní fáze alergické reakce (hodiny po styku)
•Syntéza metabolitů kyseliny arachidonové – leukotrieny,
tromboxany, prostaglandiny
1. fáze senzibilizace2. Časná a pozdní fáze
alergická reakce
Přecitlivělost I. Typu
oSenná rýma (sezónní, celoroční)
oKonjunktivitida
oAstma bronchiale typ I (eozinofilní)
oAtopický exém
oKopřivka
oAnafylaktický šok
1. fáze senzibilizace2. Časná a pozdní fáze
alergická reakce
Alergen
oExogenní antigen, který u vnímavých jedinců vyvolá patologickou imunitní reakci
oNázvosloví alergenů: vychází z latiny, např. kočka domácí:
Felis domestica
Fel d 1
První 3 písmena jména
rodového
První písmeno jména
druhového
Číslice udává pořadí
alergenů kočky, na které
reaguje nejvíce
pacientů alergických na
kočku – zde číslice 1 –
hlavní alergen kočky
lipokalin, na který
reaguje 95% pacientů
alergických na kočku
Alergeny hlavní a vedlejší
oV současnosti je známo aminokyselinové složení většiny alergenů
oRozlišení 2 skupin:
oAlergeny hlavní – látka, na kterou reaguje 50-90 % jedinců přecitlivělých na daný alergen (IgE)
např. Fel d1, Bet v 1, Ara h 1, 2, 3
oAlergeny vedlejší – reaguje na ně menšina osob vnímavých na daný alergen (<10 %)
Alergeny I. a II. třídy
Alergeny I. třídy – alergeny potravinové, senzibilizace orální cestou
o Spouští se do pár minut od konzumace potraviny
o Klinické příznaky variabilní – od svědění dutiny ústní, rtů (orální alergický syndrom, OAS) až po život
ohrožující anafylaxi
Alergeny II. Třídy – alergeny inhalační
o Často proteiny rostlin s různou enzymatickou aktivitou, např.
o Skladovací proteiny – semena, ořechy
o Inhibitory enzymů (amyláz, antitrypsin) – brání štěpení škrobů a proteinů v obilných zrnech
o Regulační proteiny – podílí se na rozmnožování rostlin
o Proteiny související s patogenezí (obrana rostliny – hevaminy – funkce podobná lysozymu)
Zkřížená reaktivita
oVelká část alergenů si je velmi podobná ve svém
aminokyselinovém složení
oAlergeny s vyšší než 50% homologií vykazují zkříženou reaktivitu
oJe-li homologie vyšší než 80 %  PANALERGENY – obsahují
fylogeneticky konzervativní sekvence AK
o Způsobují potravinovou alergii asociovanou s pyly
o 1. fáze – senzibilizace pacienta inhalačními alergeny
o 2. fáze – zkřížená reaktivita mezi proteiny inhalačních
alergenů a potravinami  potravinová alergie
Originally published December 2015 by Ellen Avery, MS, RD, CNSC
Panalergeny
Panalergeny - stabilita
Termolabilní alergeny:
• Profiliny a PR-10
proteiny
• V nativním stavu –
alergenní potenciál,
Povařením/kyselým pH
narušení 3D struktury
molekuly  narušení
epitopu  ztráta
alergenicity
• Projevuje se většinou jen
orálním syndromem
Termostabilní alergeny:
• LTP a zásobní proteiny
• Alergenní epitop tvořen
blízkými
aminokyselinami ve
struktuře molekuly
• Není ovlivněn varem ani
pH  molekuly
povařením neztrácí
alergenicitu
• Může hrozit závažná
alergická reakce!
Alergeny pro laboratorní diagnostiku
Standardizované alergenové extrakty
o Purifikace z přírodních zdrojů
o Výrobce stanoví obsah hlavních
alergenů kvantitativně (ELISA)
o Množství a aktivita alergenu se
srovná se standardem
o Kromě alergenu obsahují extrakty
také nealergenní složky (proteiny,
sacharidy…)
o Ty mohou vést k falešné pozitivitě
testů, nelze odlišit zkřížené
reaktivity
Rekombinantní alergeny
o Ze zdroje alergenu izolována RNA
o Přepis do DNA
o Vložení DNA bakteriofága
o Hostitelem bakteriofága E.Coli
o E.Coli produkuje alergen v čisté
formě
o Rekombinantní alergeny umožňují
komponentovou diagnostiku
oUrčí u pacienta konkrétní antigenní determinantu, na kterou se IgE váže
oDokážeme rozlišit, zda u pacienta po podání alergenu hrozí závažná reakce (anafylaxe)
oDále např. reakce na včelu a vosu
o U stanovení specifického IgE na včelu a vosu pomocí alergenových extraktů bývá často přítomna
zkřížená reaktivita (existuje určitá homologie ve struktuře obou jedů) – pacient falešně pozitivní na obojí
o Komponentová diagnostika dokáže odlišit, zda je pacient opravdu alergický na včelu nebo vosu (není zde
nespecifita způsobená zkříženou reaktivitou)
o  význam pro alergenovou imunoterapii
(složení alergenů, zda má význam je pacientovi podávat)
Komponentová diagnostika – stanovení
rekombinantních alergenů (RAL)
Alergologické vyšetření
1. Anamnéza
◦ Rodinná – výskyt alergií u členů rodiny
◦ Osobní
◦ Výskyt klinických obtíží po kontaktu s určitými alergeny
◦ Inhalační alergeny, potravinové, léky, hmyz, údaje o domácím a pracovním prostředí, zvířatech
◦ Jaké klinické příznaky, jak rychle se vyvíjí, jaká závažnost, jak dlouho trvají, v jakých periodách se
opakují
◦ Vyvíjí se vyrážka na kůži po kontaktu se šperky, pásky apod.?
Snaha vytipovat potenciální alergeny, na které
bude provedeno vyšetření
Alergologické vyšetření
2. Odběr krve
oPro zhodnocení celkového zdravotního stavu pacienta se odebírá krev kromě alergologických
parametrů také na:
o Biochemie – základní biochemické parametry (glukóza, tryacylglyceroly, cholesterol, hormony štítné
žlázy…)
o Hematologie – krevní obraz
o Imunologie – základní screening autoprotilátek (ANA), komplement, subpopulace lymfocytů
oPacient nemusí trpět pouze alergickým onemocněním ale i dalšími komorbiditami …
3. Alergologické vyšetření -in vivo testy
Lze je provést přímo v ordinaci alergologa
1. Prick testy – inhalační, potravní a zvířecí alergeny
2. Intradermální testy – blanokřídlý hmyz, léky
3. Epikutánní testy – kontaktní alergie (IV. Typ)
1. Prick testy
o Preanalytická fáze – pacient cca týden před provedením testu vyloučí léčbu
antihistaminiky/kortikoidy
o Aplikace standardizovaných alergenů na volární stranu předloktí
o Součástí je také negativní kontrola (fyziol.roztok) a pozitivní kontrola (histamin)
o Kontraindikace: nespolupracující pacient, pacient s kožním onemocněním
v místě provedení testu a lidé, kterým není možné vysadit léčbu
1. Aplikace kapky alergenu
2. Narušení kůže plastovým kopíčkem 3. Inkubace cca 20 min
4. Odečet velikost pupene
Aplikace alergenu do podkoží injekčně
Intradermální test
oIV. Typ přecitlivělosti
oAlergie na léky, jedy blanokřídlého hmyzu
oAplikace alergenu do podkoží pomocí injekční jehly
oNevýhoda – výsledky testu závisí na hloubce vpichu – závislé na zkušenosti
zdravotní sestry
oExistuje nízké riziko vážné reakce (léky jsou ale výrazně
naředěny, proto je riziko závažné reakce sníženo na minimum)
oPodráždění kůže může přetrvávat až 36h po provedení testu
Epikutánní test
oDiagnostika kontaktní alergie (IV.typ) – nízkomolekulární chemické látky
oPrincip – aplikace podezřelých látek ve formě náplasti na zdravou kůži zad 
odečet za 48, 72 a 96h
o Pozitivní výsledek – exém v místě kontaktu
oKontraindikace:
o Kožní onemocnění v místě aplikace testů (záda)
o Gravidita
o Příliš opálená kůže
o Imunosupresivní/imunostimulační terapie
oNelze testovat látky toxické a s extrémními hodnotami pH
https://www.dermatologiepropraxi.cz/pdfs/der/2011/03/14.pdf
4. Vyšetření dýchacích cest – diagnostika astmatu
oMěření FeNO (frakční expirační NO) – měření oxidu dusnatého ve vydechovaném vzduchu
o Při eozinofilním zánětu dýchacích cest se ve vyšší míře tvoří NO
o Koncentrace NO ve vydechovaném vzduchu koreluje se závažností eozinofilního zánětu
o Výsledky se vyjadřují v ppb (počet molekul NO na 10*9 molekul vzduchu)
oSpirometrie
o Vyšetření funkčních parametrů dýchacích cest, diagnostika obstrukce
oBronchomotorické testy
o Bronchodilatační test – podání bronchodilatancia  sleduje se reverzibilita obstrukce dýchacích cest
(reverzibilita ukazuje na astma)
o Bronchokonstrikční test – podání metacholinu (nebo fyzická zátěž)  sleduje se, zda jsou průdušky
schopny konstrikce pod vlivem vyvolávající látky (svědčí pro zánět průduškové stěny)
5. Alergologické testy in vitro - přehled
Serologické testy
1. Nefelometrie – stanovení celkového IgE
2. Immulite 2000 – stanovení specifického IgE, eozinofilní kationický protein (ECP)
Pozn. dříve se ke stanovení specifického IgE používala i ELISA - dnes už ne!! – nahrazení přístrojovými
metodami
3. ImmunoCap Phadia – stanovení tryptázy a vybraných rekombinantních alergenů
4. MADx Allergy Explorer multiplex metoda - stanovení až 280 alergenů
Buněčné testy
1. Stanovení počtu eozinofilů
2. Test aktivace bazofilů (BAT)
3. Proliferace lymfocytů a ELISPOT
Celkové IgE
oCelkové IgE - norma 0-100 IU/ml – stanovení nefelometricky
oCelková koncentrace IgE koreluje s přítomností alergického onemocnění
oPouhé stanovení celkového IgE k určení přítomnosti alergie nestačí,
protože:
o Vysoké IgE také u jiných diagnóz, např. nosní polypóza, Wiskot-Aldrich
syndrom, hyper IgE syndrom, AIDS, parazitární onemocnění
o Nízké IgE - 60 -70 % alergiků nemusí mít celkové IgE zvýšeno nad 100 UI/ml
o https://portal.med.muni.cz/clanek-695-vysetrovaci-metody-v-imunologicke-a-alergologicke-laboratori.html
senná
rýma
celoroční
rýma
astma atopický
ekzém
Celkové IgE hranice pozitivity:
100 IU/ml
Immulite 2000 – specifické IgE
(používá alergenové extrakty)
•Enzymově zesílená chemiluminiscence
•Pevná fáze – 1 velká plastová kulička potažená biotinem
•Přidáme alergen konjugovaný se streptavidinem  naváže se na kuličku
•Přidáme pacientovo sérum  vazba alergen specifického IgE
•V dalším kroku – přidáme anti-IgE protilátku značenou alkalickou fosfatázou  po přídavku adamantyl-dioxetan-fosfátu
odštěpí enzym fosfát  vzniká nestabilní aniont, který při rozkladu
uvolní emisi fotonů – zaznamená se počet záblesků
Immulite 2000 – stanovení ECP
oPrincip stanovení – chemiluminiscence - podobně jako stanovení specifického IgE (rozdíl - na
plastové kuličce je navázána záchytná protilátka anti-ECP, zbytek principu je identický)
oEozinofilní kationický protein je produkt aktivovaných eozinofilů
oJeho hladina koreluje se závažností eozinofilního zánětu
(toxicita – poškození epitelu dýchacích cest)
oPoužívá se k monitorování průběhu a léčby
eozinofilního alergického astmatu
(pokles ECP  úspěšná léčba)
oNormální hladina v séru < 24 ng/ml
Phadia Thermofisher – fluorimetrie
Pevná fáze – plastové kepíky, které obsahují aktivovanou celulózu – velká plocha
Na celulózu navázán alergen  na něj vazba pacientova IgE
V dalším kroku přídavek anti-IgE protilátky značené β-D-galaktosidázou
Přídavek substrátu  Methylumbelliferyl- β-D-galaktosid  enzym odštěpí β-D-galaktosid a
vznikne methylumberiferon  excitace světlem  emise fluorescenčního záření (na rozdíl od
Immulitu zde potřebujeme žárovku (Hg-Výbojka) k excitaci methylumbeliferonu!)
• Stanovení tryptázy
• Stanovení specifického IgE
proti rekombinantním
alergenům
ImmunoCap - Tryptáza
oUvolňuje se po aktivaci žírných buněk alergenem  marker anafylaktické reakce
o Diferenciální diagnostika anafylaktických reakcí polékových, po bodnutí hmyzem
o Také stanovení post mortem – určení anafylaktické reakce jako příčiny úmrtí
oTryptázu tvoří také mastocyty  výrazné zvýšení u systémových mastocytóz
oVýhoda tryptázy (např. v porovnání s histaminem):
o Není na rozdíl od histaminu uvolňována bazofily v krvi – vyloučena falešná pozitivita in vitro
o Je v krvi stabilní kolem 48 h  možno stanovit post mortem
o Při uchování vzorku při chladničkové teplotě – stabilní až týden
oNorma 0-13,5 ug/l
1. Na čipu jsou ve formě spotu imobilizovány nanočástice potažené
alergenem - je dána přesná poloha spotu na čipu pro konkrétní alergen
2. Přídavek diluentu
a 100ul pacientova séra
nanočástice
3. Vazba IgE na alergen
4. Přídavek anti-IgE značené enzymem
 promytí  přídavek substrátu
5. Přeměna substrátu na barevný
produkt  tvorba barevného spotu na
čipu
6. Zastavení reakce stop činidlem,
usušení čipu  odečet
ALEX – čipy obsahují až 280
alergenů, v průběhu inkubace
pacientova séra se přidává
také speciální diluent, který
obsahuje blokátor, který
eliminuje vazbu anti-CCD IgE
ALEX (allergy explorer)
ALEX (allergy explorer)
•Čipová technologie – multiplex metoda
•Stanovení až 280 alergenů v jediném kroku (čip obsahuje jak alergenové
extrakty, tak vybrané rekombinantní alergeny)
•Klinik v ordinaci indikuje pacienty pro vyšetření ALEX pouze na základě klinických projevů –
pacienti, kteří udávají mnohočetné alergie (inhalační, potravinové)
•Hodí se pro pacienty kde je podezření na zkřížené alergie
•Hladina celkového IgE nehraje při indikaci roli
•Hodnocení výsledků probíhá pomocí počítače – speciální čtečka čipů, software
•Výsledky – kUA/l, 4 semikvantitativní třídy
•Video – pracovní postup:
https://www.youtube.com/watch?v=klET1jLVmp4&ab_channel=DasitGroupS.p.A.
ALEX (allergy explorer)
oVyužití:
o Indikace pro specifickou imunoterapii
o Vyhodnocení rizik pro pacienta s cílem zabránit závažným alergickým reakcím
o Získáváme molekulární informace o zkřížené reaktivitě
Buněčné testy v alergologii
1. Stanovení počtu eozinofilů (I.typ přecitlivělosti) - rutinně
2. Test aktivace bazofilů (BAT) (I.typ přecitlivělosti) - rutinně
1. Test proliferace lymfocytů na pozdní alergickou reakci (IV. typ přecitlivělosti)
2. ELISPOT (IV. typ přecitlivělosti)
Detekce pozdních reakcí na léčiva
(pouze specializovaná pracoviště, výzkumné testy)
Stanovení počtu eozinofilů
oPrincip – hematologický analyzátor
o Hydrodynamická fokusace vzorku
o Impedanční vlastnosti buněk - počet
o Průchod světelným paprskem – vlastnosti o velikosti a granularitě
oKrevní diferenciál dospělého člověka:
o Lymfocyty: 20-45 %
o Monocyty 2-12 %
o Neutrofily 50-70 %
o Eosinofily 1-3 %
o Bazofily < 1 %
oZvýšení eozinofilů – alergická, parazitární onemocnění…
oPoužití – monitoring eozinofilního astmatu
oPři znalosti absolutního počtu leukocytů lze absolutní počty buněk dopočítat
o Leukocyty 4-10*109/l
Test aktivace bazofilů (BAT)
funkční test umožňující vyšetření aktivace bazofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro
Na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE)
CD203c Založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na
povrchu periferních bazofilů po jejich expozici
alergenem in vitro
ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní)
- sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů
Reakce přecitlivělosti jsou podstatou alergických onemocnění.
Reakce přecitlivělosti I. typu neboli IgE mediovaná alergie - je
zprostředkovaná protilátkami IgE.
IgE se naváže na bazofily ve fázi senzibilizace.
Při dálším setkání s alergenem – alergen přemostí IgE, to vede k
aktivaci bazofilů - masivnímu uvolnění produktů degranulace
bazofilů a mastocytů zvýšená exprese CD63 a CD203c
na aktivovaných bazofilech.
Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno
Vyšetření periferní
heparinizované krve,
stimulace alergenem
při 37 °C ve vodní lázni,
zastavení reakce, lýza
erytrocytů a měření na
průtokovém cytometru
Test aktivace bazofilů (BAT)
oBazofily v neaktivovaném stavu exprimují v nízké míře znak CD203c, jsou CD63 negativní
oPři aktivaci a degranulaci se zvyšují znaky CD63 a CD203c  měření pomocí průtokové
cytometrie
oProvedení testu – prestimulace plné krve s IL-3  následuje přídavek alergenu  inkubace 
promytí  značení protilátkami (anti-CD63, anti-CD203c, anti-IgE)  promytí  lýza erytrocytů
BAT – alergeny
oVětšinou se používají alergeny z prick testů
oU podezření na lékové alergie doktor spolu s krví zasílá do laboratoře podezřelý lék  v laboratoři
rozdrcen, přefiltrován a naředěn
oU každého BAT testu se požívá ředění alergenu v pořadí 10krát, 100krát a 1000krát  proč?
oNěkdy může být koncentrace alergenu natolik velká, že bazofily se výrazně naaktivují a během
inkubace podlehnou nekróze  výsledkem měření je falešná negativita
oProto se může stát, že např. při ředění 10krát je reakce negativní, ale pozitivní v ředění 100krát!!
BAT – gatovací strategie
(Pacient alergický na kočku – alergen Fel d)
1. Na Forward
scatteru a Side
scatteru gatovány
lymfocyty
2. Z lymfocytů
gatovány pouze IgE
pozitivní buňky -
bazofily
3. Bazofily –
sledujeme CD63
a CD203c
Negativní kontrola
Bazofily jsou CD63 neg.
Pozitivní pacient – vidíme
populaci CD63 pozitivních
bazofilů
o Při vyšetření BAT u pacienta je součástí testu
vždy:
o Negativní kontrola (PBS)
o Pozitivní kontrola (stimulace fMLP)
o 3 ředění alergenu (10x, 100x, 1000x)
Hodnocení:
Alergenové extrakty: pozitivita ≥ 15% CD63+ bazofilů
Léčiva: pozitivita ≥ 5% CD63+ bazofilů
Proliferace lymfocytů (LTT, lymphocyte transformation test) –
metoda H3 thymidyn
oPacienti se závažnými reakcemi na léky  IV. Typ přecitlivělosti dle Coombse a Gella
oPrincip: inkubace lymfocytů pacienta s podezřelým lékem 7 dní v médiu  poté měření
proliferace pomocí metody H3 thymidyn
o Součástí testu též negativní kontrola (PBS), pozitivní kontrola (PHA, ConA) a zdravá kontrolní osoba!
oPokud lymfocyty proliferují, je daný lék považován za spouštěč pozdní alergické reakce
oÚskalí:
o Testován je přímo lék, ale ne jeho metabolity (některé léky se biotransformují na metabolity které mají
daný účinek)
o Některé léky přímo působí jako inhibitory proliferace (např. prostaglandin E2  útlum produkce IL-2)
o Možnost falešné pozitivity bez klinických příznaků pacienta  nutno vždy hodnotit výsledky spolu s
klinickými daty
ELISPOT
(pouze specializovaná pracoviště)
oPrincip:
1. Izolace PBMC
2. Nasazení PBMC do jamek ELISPOT destičky, jejíž dno je pokryto protilátkou proti IFN-γ
3. Přídavek podezřelého léku k buňkám
4. Inkubace 24-72h (pokud se antigen specifické lymfocyty lékem aktivují, budou produkovat IFN-γ)
5. Odmytí buněk, přídavek detekční protilátky proti IFN-γ značené enzymem
6. Přídavek substrátu  vývoj barevných spotů
Příklad – pacient s pozdní reakcí na klindamycin – projevil se exantémem po těle,
nutná hospitalizace
Vpravo patrná silná pozitivita – lymfocyty po styku s klindamycinem tvořily IFN-γ
(359 spotů, vs. 19 spotů u kontroly)
Vhodné pro pacienty se závažnými reakcemi, kde nelze provést kožní/expoziční
testy PacientKontrolní osoba