Vyšetření funkce komplementu Mgr. Julie Štíchová FN u Sv. Anny v Brně Komplement oObjev – Jules Bordet – termolabilní substance v plazmě oSložka nespecifické humorální imunity oSystém několika desítek proteinů, většina tvořena v játrech oVelmi rychlá aktivace oSilné zánětotvorné a lytické účinky Komplementový systém tvoří: • Centrální proteiny C1-C9 • Komplementové receptory na buňkách • Stabilizátory komplementu • Inhibitory komplementu • Solubilní • Membránově vázané Komplement oAktivovaný komplement podporuje: o Rozvoj zánětlivé reakce (anafylatoxiny – C3a, C4a, C5a) o Opsonizace (C3b, C4b) o Chemotaxe (C3a, C5a) o Lýza buněčných membrán (C5b-C9 – MAC) o Odstraňování imunokomplexů z cirkulace (C3b, C4b) Komplement - funkce oOdstraňování imunokomplexů z cirkulace (C3b)  vazba na CD35 (CR1) na RBC  zabránění tvorby velkých imunokomplexů likvidace ve slezině/játrech oNapomáhá odstraňování apoptotických tělísek makrofágy (opsonizace) RBC Makrofág Zdroj: Janeway Immunobiology 8th edition Regulace komplementu oAktivovaný komplement má amplifikační potenciál, nutná důsledná regulace 1) Regulátory pozitivní: o Properdin (faktor P) – stabilizace alternativní C3 konvertázy 2) Regulátory negativní a) Solubilní: ◦ C1 inhbitor (C1INH) ◦ Faktor H ◦ Faktor I b) Membránově vázané: ◦ Membrane cofactor protein – MCP (CD46) – všechny jaderné buňky ◦ Decay accelerating factor – DAF (CD55) – např. na RBC ◦ Protektin (CD59) - např. na RBC Když ochrana chybí oOnemocnění paroxyzmální noční hemoglobinurie oMutace genu pro GPI kotvu v hematopoetické kmenové buňce o na povrchu RBC deficit proteinů, které jsou normálně pomocí GPI kotvy vázány o DAF (CD55) – inhibice C3 a C5 o Protektin (CD59) – inhibice formace MAC oRBC citlivé ke stopovým množstvím aktivovaného komplementu v séru lýza Vyšetření komplementu oKvantitativní stanovení jednotlivých složek komplementu oVyjádření výsledků – koncentrace g/l, mg/l 1) Nefelometrie – stanovení složky C3, C4, C1Q, C1-INH, MBL 2) Radiální imunodifuze (RID) ◦ Kvantitativní stanovení C2 a C5 složky komplementu ◦ V gelu protilátka proti C2 nebo C5 ◦ Sérum pacienta difunduje do gelu ◦ V zóně ekvivalence se vytvoří precipitační prstenec ◦ Čím vyšší koncentrace C2/C5, tím větší průměr prstence 3) ELISA (funkční testy CH, AH a C1 inhibitoru) Komplement – normální hodnoty oC1q (100-250mg/l) oC2 (10 – 30 mg/l) oC3 (0,7 – 1,5 g/l) oC4 (0,1 – 0,4 g/l) oC5 (80 – 170 mg/l) oMBL (> 0,3mg/l) oC1 inhibitor (210 – 390 mg/l) Hemolytický test CH50 oScreeningová metoda oZjištění funkčnosti klasické cesty aktivace komplementu oDetekce snížené funkce komplementu oVýsledky se vyjadřují v % aktivace oSérum zpracovat do 1 hodiny oProč CH50? Jednotka CH50 Množství séra, které za standardních podmínek způsobí 50% lýzu definované suspenze beraních erytrocytů - 30 min, 37 stupňů Negativní – RBC jsou neporušené na dně jamky Pozitivní – RBC byly lyzovány komplementem – v SN je přítomna hemolýza Funkční vyšetření komplementu oFunkční hemolytické testy – CH50 (klasická cesta), AH50 (alternativní cesta) o Zjištění funkčnosti klasické nebo alternativní cesty komplementu o Lýza definované směsi beraních RBC komplementem nárůst absorbance v supernatantu vlivem uvolněného Hb o Výsledky se vyjadřují v % aktivace Funkční vyšetření komplementu - ELISA oV mnohých laboratořích CH50/AH50 nahrazeno ELISA metodou o Princip – na dně jamky aktivátor určité cesty komplementu  detekce neoepitopu při formaci membranolytického komplexu pomocí enzymem značené monoklonální protilátky  vznik zbarvení Klasická Lektinová Alternativní C1-INH funkční test - ELISA oSérum nebo plazma se inkubuje s reaktantem - aktivovanou exogenní složkou C1s (je součástí setu), která je vazebným místem pro C1-INH oPokud je C1INH funkční, naváže se na C1s oNásleduje odmytí nenavázaných složek o Do jamky se následně přidá konjugát - kozí protilátka proti lidskému C1-INH - značená křenovou peroxidázou (přeměna substrátu na barevný produkt) oSpektofotometrie - určí množství navázaného C1-INH oNefunkční C1INH – ke zbarvení nedojde, protože se neutvořily detekovatelné komplexy C1s-C1INH oSnížená funkce C1INH – méně intenzivní zabarvení  snížené % aktivace oVýsledky ELISY C1INH funkční test - % aktivace Indikace k vyšetření komplementu oPodezření na funkční deficit komplementu o Testuje se CH50/AH50 (screening)  v případě snížení se stanoví koncentrace jednotlivých složek oMonitorování zánětu o Složky komplementu se chovají jako pozitivní reaktanty akutní fáze – ↑↑ koncentrace (C3, C4) oMonitorování imunokomplexových chorob o Silná aktivace komplementu – dochází ke konzumpci jeho složek – ↓↓ koncentrace oPodezření na poruchu regulátorů komplementu – C1 inhibitor + složky C3 a C4 (+ funkční testy) Deficience složek komplementu oDeficience C1–C4 (podílí se na odstraňování imunokomplexů) oČastý výskyt imunokomplexových chorob (SLE-like) oNáchylnost k pyogenním infekcím oDeficience C3-C9 ◦ Náchylnost k pyogenním infekcím ◦ Deficit C9 – typicky opakované neisseriové infekce – meningokoková meningitida o Deficience MBL – častější infekce u dětí Hereditální angioedém oZpůsoben deficitem C1 inhibitoru (C1 INH) – který inhibuje serinové proteázy C1r, C1s (ireverzibilní vazba – C1 INH se spotřebovává) oDůsledek: 1) Aktivace klasické cesty komplementu – konzumpce složek, zejména C2 a C4 (provokující faktory – menstruace, stres, zubní zákroky….) 2) Nedostatečná regulace kininového systému (C1 INH inhibuje také kalikrein) Mechanismus: C1 INH není schopen dostatečně tlumit přeměnu prekalikreinu na kalikrein  Kalikrein štěpí vysokomolekulární kininogen na bradykinin  ten se váže na bradykyninové receptory na endoteliích  vazodilatace, zvýšená permeabilita cév (lokálně)  vznik nezánětlivého edému Hereditální angioedém Klinický obraz: oEpizodické otoky, edémy – podkoží, pod sliznicí oBledá barva otoků, nesvědivé, bez lokální zvýšené teploty oMohou být bolestivé – napětí ve tkáních oVětšinou se vyvíjejí postupně, během 12-36h oOtoky nereagují na antihistaminika, nedostatečně na kortikosteroidy oKlinické obtíže značně variabilní – dle výskytu otoku oOtok v oblasti krku – nebezpečný – hrozí udušení oOtok v oblasti břicha – připomíná akutní příhodu břišní oÚtlak močových cest, střeva  retence moči, střevní neprůchodnost Hereditální angioedém Typ 1: porucha tvorby C1INH, 85% nemocných ◦ Snížení C1INH na 12-50%, C3 v normě, snížené C2 a C4 – kvantitativní snížení C1INH Typ 2: Funkční porucha C1INH ◦ C1INH může být snížený, v normě i zvýšený, ale je funkčně neaktivní, snížené C2 a C4 – funkční porucha C1INH Typ 3: estrogen dependentní – mutace FXII • Bez abnormalit v množství a funkčnosti C1 INH Vyšetření u hereditálního angioedému (HAE) oScreeningový test HAE: vyšetření C4 složky  pokud je snížená následuje: oVyšetření koncentrace a funkce C1 INH oStanovení dalších složek komplementu: C2, C3, C5 oVyloučení získaného angioedému: stanovení C1q oPotvrzení diagnózy pro HAE typ I a II: Genetické vyšetření – mutace v genu pro C1 INH CH50 Reagencie: 1) 5% suspenze beraních erytrocytů – již připraveno ◦ (Příprava: Beraní krev 3 krát proprat fyziologickým roztokem, naředit na 5%) 2) Amboceptor – králičí protilátka IgM proti beraním RBC – již připraveno ◦ (Příprava: rozpustit lyofylizovaný prášek od výrobce v 1 ml destilované vody, poté naředit v poměru 1:100 ve fyziologickém roztoku, např. 20 ul amboceptoru + 1980 ul fyziol. Roztoku) Krok 1: Příprava hemolytického systému Do 5% suspenze RBC (2 ml) přidejte stejné množství amboceptoru (ne naopak!) Inkubace 15-30 min v lednici CH50 Krok 2: Nařeďte kontrolu a pacienta ve dvou ředěních: Kontrola Pacient 1:40 1:401:60 1:60 Ředění 1:40 25 ul séra + 975 ul fyziol. roztoku Ředění 1:60 15 ul séra + 885 ul fyziol. roztoku CH50 Krok 3: Příprava ředění Světle modrá barva: 100 ul fyziologického roztoku Tmavě modrá barva 100 ul destil. vody CH50 100 ul sér v ředění 1:40 KONTROLA PACIENT 100 ul sér v ředění 1:60 CH50 ODPAD ODPAD CH50 Krok 4: Do všech jamek přidejte 100 ul hemolytického systému (konečný objem ve všech jamkách - 200 ul) Krok 5: Inkubace 60 min v termostatu Krok 6: Centrifugace 5 min/2000 ot./min CH50 Krok 7: Po centrifugaci přeneste 100 ul supernatantu z každé jamky do nové (sloupec 5-8) Pozor, nesmí se nabrat pelet na dně jamek! Krok 8: Měření absorbance na ELISA readeru - program CH50 CH50 - vyhodnocení Jamka s fyziologickým roztokem = blank - 0% hemolýza (pozice 6H, 8H) Jamka s destilovanou vodou = 100% hemolýza (pozice 5H, 7H) 1) Z dubletů spočítat průměr absorbance pro každé ředění 2) Z průměrné absorbance (A) spočítat % lýzy pro každé ředění dle vzorce: 𝐀 𝐝𝐚𝐧é𝐡𝐨 ř𝐞𝐝ě𝐧í − 𝐀 𝐛𝐥𝐚𝐧𝐤𝐮 𝐀 𝟏𝟎𝟎% 𝐥ý𝐳𝐲 − 𝐀 𝐛𝐥𝐚𝐧𝐤𝐮 × 𝟏𝟎𝟎 = % 𝑙ý𝑧𝑦 𝑝𝑟𝑜 𝑑𝑎𝑛é ř𝑒𝑑ě𝑛í CH50 - hodnocení 3) Sestrojit graf – závislost procenta lýzy na ředění (kontrola i pacient) – 1 graf Odečíst ředění při 50% lýze  je aktivita komplementu u pacienta srovnatelná nebo nižší v porovnání s kontrolou? CH50 - protokol 1) Úvod – co je to komplement, jak se stanovuje 2) CH50 – princip metody 3) Pomůcky 4) Stručně popsat pracovní postup 5) Výsledky – konkrétní výpočty (na 1 příkladu detailně rozepsat vzorec výpočtu) + graf 6) Interpretace výsledků – Co nám vyšlo, co výsledek pro pacienta znamená? 7) K protokolu přiložit list s naměřenými absorbancemi (přepsat surová data absorbance do tabulky ve wordu + popsat, co je v které jamce)