Imunoelektroforéza Imunofixace Mgr. Julie Štíchová ÚKIA-FNUSA Klasická elektroforéza - screening • Separace proteinů séra na základě rozdílné pohyblivosti v el. poli • Médium – agarózový gel • pH = 8,6 → anodická pohyblivost (většina proteinů izoel. bod kolem pH 5 - 6) • Rozdělení do 5 základních frakcí • Odečítání – většinou denzitometrie • Pokud známe koncentraci celkové bílkoviny → přepočet % na koncentraci jednotlivých frakcí • Imunologie – zájem o gamafrakci Pozn. Detailní princip elektroforézy a denzitometrie lze najít v učebnicích klinické biochemie nebo instrumentální techniky Elektroforetické frakce obsahují tyto plazmatické proteiny Elektroforetické frakce obsahují tyto plazmatické proteiny imunoglobuliny - lze zachytit pouze hrubé změny: hypergamaglobulinémii, hypogamaglobulinemii či monoklonální gamapatie Elektroforéza sérové proteiny mohou být elektroforeticky separovány Využití elektroforézy v klinické praxi screening chorobných stavů • Vyšetřovaný materiál: sérum, moč, likvor Hyperproteinémie – hypergamaglobulinemie je vzácná: • Zánět • monoklonální gamapatie (v moči – Bence-Jonesova bílkovina) • chronické dlouhotrvající infekce, např. AIDS (zvýšená syntéza imunoglobulinů) • Některé autoimunitní onemocnění – např. Sjögrenův syndrom Hypoproteinémie - většina chorobných stavů: • porucha syntézy bílkovin v játrech • nadměrné ztráty – nefrotický syndrom (vyšetření moči – zvýšené koncentrace bílkovin) • poruchy výživy – malnutrice • poruchy trávicího traktu – maldigesce a malabsorpce – nespecifické střevní záněty (Crohnova choroba, ulcerózní kolitida) • Rozsáhlé popáleniny • Hyperhydratace – dochází k naředění bílkovin séra – těhotenství (fyziologicky), nevhodně podaná infuze Klasická elektroforéza - screening ↓ ↑ ↑ ↑ Nevýhoda – detekce pouze velkých změn v proteinových frakcích Zánět Hypergamaglobulinemie (monoklonální gamapatie) Hypogamaglobulinemie ↓ ↓ ↑↑ Využití elektroforézy v klinické praxi screening chorobných stavů • Izoelektrická fokusace: kvalitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů • Vyšetřovaný materiál: Likvor (CSF) + sérum (S) současně • Intratékální syntéza protilátek v centrálním nervovém systému pochází z perivaskulárních infiltrátů B lymfocytů, které lokálně proliferují, dozrávají v plazmocyty a produkují příslušné protilátky • Diagnostika roztroušené sklerózy – průkaz oligoklonálních pásů v likvoru (pozitivita až v 98% případů) • Obrázek vpravo: oligoklonální pásy jsou přítomny pouze v likvoru (CSF), zatímco v séru chybí – jedná se o intratékální syntézu Ig – tento nález je pro roztroušenou sklerózu poměrně typický • Hematolikvorová bariéra – neumožňuje přestup imunoglobulinů z krve do likvoru Modifikace elektroforézy - Imunofixace • Použití: • Identifikace paraproteinu- sérum, moč a likvor • paraprotein = monoklonální imunoglobulin • produkován 1 klonem B-lymfocytů • stav, kdy má pacient v séru paraprotein se nazývá paraproteinémie nebo též monoklonální gamapatie Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html Elektroforéza Příklady elektroforetického rozdělení řady pacientských sér Ohraničený band v γ- globulinové oblasti = pacienti k dovyšetření imunofixací Monoklonální gamapatie • Onemocnění s výskytem monoklonálního imunoglobulinu v séru • Monoklonální gamapatie nejasného významu (MGUS) • Mnohočetný myelom • Plazmocytom • Waldenströmova makroglobulinemie • AL amyloidóza • Nemoci těžkých řetězců • Imunofixace slouží k: • Diferenciální diagnostice gamapatie • Sledování vývoje onemocnění v čase • Sledování terapie • Vyšetření séra + moči současně!! Imunofixace - zpracování Na agarózový gel se na pozici start nanesou pomocí šablony séra pacientů (1 pacient = 6 drah) Šablona = umělohmotný proužek s vyřezanými tvory který se přiloží na vyznačené místo na gelu pro start Start – místo přiložení šablony Agarózový gel před elektroforetickým rozdělením Agarózový gel po elektroforetickém rozdělení Na agarózový gel se po elektroforetickém rozdělení vzorků séra se přiloží maska - umělohmotná fólie s vyřezanými otvory tak, aby se na jednotlivé linie dalo aplikovat příslušné antisérum Vyřezaný otvor Maska Při inkubaci s monospecifickými antiséry dochází k jejich vazbě na příslušné molekuly imunoglobulinů a dochází k precipitaci Po uplynutí inkubační doby se celý gel zahřeje na 60°C, čímž dojde k denaturaci vzniklých precipitátů a jejich přilnutí k podkladové membráně gelu. • Pro vyhodnocení se provádí barvení imunofixovaných vzorků a poté jejich vyhodnocení. • Pokud vyšetřované sérum nebo moč pacienta obsahují zmnožený jeden klon imunoglobulinů nebo jen jejich část – κ nebo λ řetězce - vytvoří se ohraničený proužek tzv. band (paraprotein) • Při vyhodnocování platí pravidlo, že band –paraprotein- v původním elektroforetickém rozdělení musí mít ve všech pruzích stejnou polohu ve vzdálenosti od startu. Stejná poloha paraprotienu vzhledem ke startu Imunofixace – odečítání výsledků Polyklonální Ig – zdravý člověk Pacient s paraproteinem IgG λ a lehkými řetězci λ Pacient s paraproteinem IgA κ Imunofixace – odečítání výsledků Pacient s paraproteinem IgM λ Pacient s paraproteinem IgM κ MOČ Volné lehké řetězce λ Biklonální gamapatie IgG κ + IgM λ