Klasické serologické metody
aglutinace / precipitace, RID, nefelometrie / turbidimetrie
Vyšetření funkce komplementu
Jana Nechvátalová (jana.nechvatalova@fnusa.cz)
Ústav klinické imunologie a alergologie
FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
Laboratorní vyšetrení IN VITRO
• Preanalytická fáze
- odběr, příprava, zpracování vzorku před zahájením laboratorního vyšetření
- skladování, transport
• Analytická fáze
- kalibrace a justování zařízení (analýza kontrol- IKK, EHK)
- provedení lab. vyšetrení + kontrol
- zpracovaní výsledků, LIS
• Postanalytická fáze
- skladování, likvidace materiálu
- prozkoumání výsledků, uvolnění, LIS - NIS
Rozdelení imunologických laboratorních metod
• serologické (humorální)- detekce antigenů a protilátek, průkaz tvorby
protilátek proti infekčnímu agens
• bunečné - počty a funkce jednotlivých typů leukocytů
Serologické metódy
1. Klasické serologické metody
- Aglutinace (přímá / nepřímá)
- Precipitace (v kapalině, v gelu)
2. Imunochemické metody s následnou detekcí
- Imunofluroscence (přímá / nepřímá)
- Imunoanalýza (EIA-ELISA, RIA, FIA, LIA)
- Imunoblot, imunodot
3. Metody založené na efektorovém účinku protilátek (využívané v
klinické mikrobiologii)
- Komplement fixační reakce
- Inhibiční a neutralizační testy
Serologické metody
Reakce antigenu (Ag) s protilátkou (Ab) = imunokomplex:
• Primární – rychlá, nepozorovatelná okem
fáze – tvorba imunokomplexů Ag + Ab
– vznik vazby jednotlivých epitopů s vazebnými místy protilátek
• Sekundární – pomalá, pozorovatená okem
fáze – uplatňuje sa multivalence Ag a polyvalence Ab
– vznik prostorového komplexu
Pokud nedochází k sekundární fázi reakce, je nutné imunokomplexy vzniklé v primární fázi
vizualizovat – imunochemické metody
http://www.wikiskripta.eu
Aglutinace vs Precipitace
Aglutinace (shlukování)
Ag + Ab → Ag-Ab
aglutinogen aglutinin aglutinát
makromolekulární imunokomplex „shluk“
korpuskulární
nerozpustný
Protilátky namířené proti epitopům antigenních částic. Mezi korpuskulemi se tvoří můstky, které vedou ke vzniku shluků
(aglutinátů)
Precipitace (srážení)
Ag + Ab → Ag-Ab
precipitogen precipitin precipitát
nízkomolekulární imunokomplex „sraženina“
nekorpuskulární
rozpustný
Reakce mezi solubilním antigenem a protilátkou s následným vznikem precipitátu (hydrofobni vazby – nerozpustný komplex)
Aglutinace
1. Přímá
- korpuskulární Ag přirozeně nese cílové epitopy
- identifikace bakterií, hemaglutinace
2. Nepřímá
- rozpustný antigen navázaný na povrchu vhodných
makromolekulárních částic (latex)
- stanovení protilátek RF, ASLO
Krvní skupiny
Systém AB0
Detekce protilátek vázaných na
erytrocyty in vivo
- autoimunitní hemolytická anémie
Detekce volných protilátek
proti erytrocytům v séru
- těhotné Rh- ženy
Hodnocení aglutinace
• KVALITATIVNÍ
- k aglutinaci dochází / nedochází (pozitivní / negativní)
• KVANTITATIVNÍ
- stanovení najvyššího ředění séra, kdy je ještě pozorovatelná aglutinace
- titr = převrácená hodnota ředění séra
(ředění 1:32 → titr 32)
Revmatoidní artritida
• Systémové autoimunitní onemocnění – poškození kloubů
• Příčiny – genetika + faktory vnějšího prostředí
• Citrulinace peptidů – modifikace vedoucí k antigenicitě proteinů→
imunitní reakce, produkce autoprotilátek
• V kloubu se tvoří zánětlivá tkáň – pannus – narušení chrupavky
• Osteoklasty – degradace kosti
• muži : ženy 1 : 2-3
• 1 % populace
• Vyšetřujeme koncentraci protilátek:
- revmatodní faktor (RF)
- protilátky proti cyklickým citrulinovaným peptidům
(anti-CCP)
- protilátky proti mutovanému citrulinovanému vimentinu (anti-MCV)
Autor obrázku: Osmosis, video zde: https://www.youtube.com/watch?v=EB5zxdAQGzU&ab_channel=Osmosis
Latex-fixační test
• Revmatoidní faktor (RF)
- autoprotilátka namířená proti Fc části IgG molekuly
- přítomný asi u 80% pacientů s revmatoidní artritidou
- pozitívní je též u asi 5-10% nemocných s jinými systémovými autoimunitami autoimunitní
hepatitida, SLE, Sjogrenův syndrom
- může být pozitivní i u zdravých osob
- diagnosticky najdůležitejší je RF v třídě IgM (rutinně se měří nefelometricky!)
Princip testu aglutinace na nosičích:
Úkol č. 1
Stanovení RF pomocí latexové aglutinace
Streptokoková infekce a pozdní následky
• Streptokoky skupiny A mají na povrchu M protein - jeho struktura je podobná
strukturám srdce nebo ledvin – molekulární mimikry
• Protilátky proti M proteinu zkříženě reagují s těmito strukturami →
poststreptokoková revmatická horečka, karditida, glomerulonefritida
• Během streptokokové infekce se také tvoří
ASLO – anti-streptolyzin O antibodies
• Stanovuje se při podezření na poststreptokokové
následky
Stanovení ASLO (ASO) nepřímou aglutinací
• ASLO - anti-streptolysin O antibodies
• Stanovení protilátek v séru proti Streptolysinu O (exotoxin bakterií z rodu
Streptococcus)
• Princip testu:
- stejný jako u RF – latexová aglutinace (na latexových částicích vázán
streptolyzin O)
Precipitace
1. V gelu
- Jednoduchá RID
- Dvojitá RID
2. V tekutém prostředí
- Nefelometrie
- Turbidimetrie
Precipitacie v gelu – jednoduchá RID
• Prostředí – agarózový gel
• Princip
1. Do gelu je při teplotě těsně před tuhnutím přidána protilátka
proti hledanému antigenu (např. chceme stanovit C5 →
v gelu protilátka proti C5)
2. Ztuhnutí gelu
3. Vykrojení jamek do gelu
4. Pipetujeme kalibrátory a vzorky
5. Antigen difunduje do gelu – v místě ekvimolární koncentrace
Ag-Ab se vytvoří kruhový precipitát
6. Průměr a plocha kruhu je úměrná množství antigenu ve
vzorku
Radiální imunodifúze
• Pomocí RID je možné stanovit koncentrace mnohých bílkovinových součástí séra
• Metodika se v minulosti používala při měření hladin celkového IgG, IgA, IgM,
složek komplementu anebo různých proteinů akutní fáze- vštšina těchto vyšetření
je dnes automatizovaná (nefelometrie)
• Stanovení C2 a C5 složek komplementu
• Jednoduchá RID
- koncentrační gradient jednoho z reaktantů
(většinou Ag)
- druhý reaktant (většinou Ab)- rovnoměrně
rozptýlený v struktuře gelu
- výsledkem jsou ostře ohraničené kruhy precipitátu
- plocha prstence = úměrná koncentraci
vyšetřovaného Ag
- podle konc. standardu – kalibrační křivka
• Dvojitá RID (podľa Ouchterlonyho)
- sledujeme antigenní přbuznost antigenů
- Prostředí – čistý gel – do jamek pipetujeme antigen i
protilátku
- gradient vytváří jak Ag tak Ab a dochází k protisměrné
difuzi obou reaktantů (radiálně)
- v zóně ekvivalence – precipitační linie, která ukazuje na
pozitivitu reakce
- hodnocení: kvalitativní
Precipitace - v tekutém prostředí
• Využívá se efekt, že při reakci Ag-Ab vzniká zákal - precipitát, jehož intenzita je při
konstantním množství přidané protilátky úměrná koncentraci vyšetřovaného
antigenu
• Měření intenzity zákalu: nefelometrie, turbidimetrie – Tyndalův jev
• Obě metodiky umožňují kvantitativní stanovení obsahu proteinů ve vzorku
odečtením z kalibrační křivky
Nefelometrie a turbidimetrie
• Reakce založené na měření množství imunokomplexů vytvořených interakcí
specifických protilátek s antigenem
• Stanovení sérových bílkovin
• Měření probíhá v tekutém prostředí v měřící kyvetě (pufr, látka urrychlující reakci,
Ag, Ab)
• Množství vytvořených komplexů je úměrné koncentraci Ag
Precipitace v tekutém prostředí
Nefelometrie
- vhodná pro nižší koncentrace
viditelné světlo
detektor je ve směru kolmém na
vstupující paprsek
Měří množství světla
rozptýleného při průchodu paprsku
(množství světla odraženého od
vznikajících komplexů)
Turbidimetrie
- Vhodná pro koncentrovanější roztoky
viditelné světlo
detektor je v ose paprsku
Měří množství procházejícího světla
(úbytek intenzity světla, které prošlo
roztokem v kyvetě)
nefelometrie je 5-10x citlivejší
a nákladnější než turbidimetrie
Dynamika precipitačních reakcí
Imunoprecipitační křivka (Heidelberg-Kendallova)
1) Oblast nadbytku protilátky – měření přístrojem
2) Zóna ekvivalence
3) Oblast nadbytku antigenu – protilátka spotřebována,
imunokomplexy se rozpadají a odezva
na detektoru klesá → Hook efekt
Závěr: Pro 2 rozdílné koncentrace antigenu lze získat jednu
hodnotu absorbance → riziko falešně nízkých hodnot
Přístroje mají různé postupy, jak Hook efekt rozpoznat
nadbytek
protilátky
nadbytek
antigenu
Množství antigenu
Různé množství antigenu - stejná hodnota absorbance
Vzorek 1 - koncentrace stanovované látky leží v oblasti nadbytku protilátky
Vzorek 2 – koncentrace stanovované látky leží v oblasti nadbytku antigenu (falešně nízká absorbance)
Pro stanovení koncentrace analytu metodou imunoprecipitace v roztoku musí být v reakční směsi nadbytek protilátky!
Při nefelometrickém i turbidimetrickém měření musí zůstat
zachována podmínka nadbytku protilátky v reakční směsi
Měření zákalu je relevantní pouze ve
vzestupné části křivky – probíhá kinetickým
proměřováním vzorku s intervalem 5 vteřin
Po proběhlé reakci přístroj do reakční směsi přidá antigen:
1) Pokud absorbance opět stoupne (3) měření proběhlo v
oblasti nadbytku protilátky (tvoří se nové
imunokomplexy) a pro výpočet koncentrace analytu tedy
může být použita naměřená hodnota absorbance
původního ředění
2) Pokud po přídavku antigenu k nárůstu signálu nedojde
(4) → protilátka byla spotřebována (příliš mnoho
antigenu) → analýza musí být opakována znovu s vyšším
ředěním vzorku
Beckman Coulter IMMAGE 800
• Stanovení koncentrace:
• I:
- imunoglobuliny: IgG, IgA, IgM (g/l)
- proteiny akutní fáze: CRP (mg/l)
- (RF+ASLO)
• II:
- Podtřídy Ig
- složky komplementu: C3, C4, C1q
- proteiny akutní fáze: A1AT (alfa 1 antitrypsin),
OROSO (orosomukoid), A2M (alfa 2 makroglobulin),
CPL (ceruloplasmin), TRF (transferin), PREA
(prealbumin)
www.beckmancoulter.com/en/products/protein-
chemistry/immage-800
Referenční meze pro dospělého
• IgG – 7,5 - 15,5 g/l
• IgG1 → IgG2 → IgG4 → IgG3
• IgA - 0,8 – 4,5 g/l
• IgA1 → IgA2
• IgM – 0,5 – 3 g/l
• IgE < 100 kU/l
• IgD < 100 IU/ml
• CRP - 0-8 mg/l
Siemens BNII
• Stanovení koncentrace:
- imunoglobuliny: IgE (IU/ml), IgD,
IgA1, IgA2, IgA pediatrické (IgAp,
nízke koncentrace)
- složky komplementu: C1 inhibitor
www.healthcare.siemens.com/plasma-protein/systems/bn-ii-system
Vyšetření cirkulujících imunokomplexů – CIK
turbidimetrie
• Imunokomplexy vznikají při normální imunitní odpovědi organismu na antigenní
podnět. Např. při každodenní obraně organizmu vůči původcům infekčních chorob
(jde tedy o jednu z fyziologicky probíhajících forem imunitní odpovědi)
• Porušena rovnováha mezi tvorbou a eliminací imunokomplexů
• Při onemocněních (např. chřipka) se tvoří imunokomplexy – bolest svalů a kloubů
• Pouze přechodné obtíže (fyziologické) → odstranění ve slezině (makrofágy)
• Autoimunitní onemocnění – tvorba imunokomplexů → ukládání do tkání → zánět
• V určité fázi onemocnění je lze detekovat v krvi – CIK-PEG (precipitace
imunokomplexů polyethylenglykolem) → zákal → měření turbidity (prošlého
světla)
CIK –PEG – pouze orientační vyšetření
• Nevýhoda:
• Detekují se jakékoli imunokomplexy – pozitivní u jakékoli akutní fáze infekce
kde se tvoří Ab-Ag → přítomnost imunokomplexů nemusí pro pacienta nutně
znamenat zdravotní problém
• Ale zároveň: negativní výsledek neznamená, že je pacient zdravý →
imunokomplexy se již mohly uložit do tkání a v krvi nejsou detekovatelné
• Typicky pozitivní u imunokomplexových systémových autoimunit – RA, SLE
• Malá výpovědní hodnota
• Alternativou je stanovení vazby imunokomplexů na C1q (ELISA) – stanoví se
pouze ty imunokomplexy, které mají schopnost aktivovat komplement
Denní praxe na analyzátoru
➢Provozní denník
➢Údržba analyzátorov:
- denní/týdenní/měsíční
➢Kalibrace:
- 1x měsíčně / při změně šarže reagencií
- kalibrační křivka
➢Kontroly IKK:
- každý den, před zahájením měřaní pacientských vzorků
- Podle metody – jedno-/více-úrovňové (nízká, vysoká kontrola)
- referenčné meze
➢Kontroly EHK (SEKK- systém externí kontroly kvality):
- podle časového plánu
- z externí laboratře (není známá výsledná koncentrace)
- výsledky se ve formě protokolu odošlou zpět organizátorovi
- organizátor porovná výsledky měření jednotlivých laboratoří a zpětně informuje o úspešnosti
Lewey-Jenningsův diagram – sledování kontrol v čase
Westgardova pravidla – detekce chyb v
analytické proceduře (rozhoduje o schválení či
zamítnutí analytické série)
Průchod vzorku laboratoří
➢Sérum = odběr srážlivé krve
➢Alikvotace vzorků
➢Vytvoření pracovního listu pro jednotlivé analyzátory = seznam vzorků
➢Analyzátor = vzorek + specifické antisérum + pufr (stabilizaca a urychlení reakce)
➢Analyzátor prepojený s LIS (laboratorní informační systém)= získá informace o
požadovaném měření + výsledek automaticky odešle
Interpretace výsledků
• Výsledky jsou před vydáním vícnásobně kontrolované
• Pozor:
➢ falešná pozitivita (malá specificita testu)
➢ falešná negativita (malá senzitivita testu)
• Hladina imunoglobulínov IgG, IgA, IgM (g/l):
↑ - zánětlivé procesy infekčního původu
- jedna třída = myelom; monoklonálna gamapatia
- zvyšování s věkem
↓ - poruchy tvorby = imunodeficity
- lymfomy, leukémie, myelomy, následkem léčby, nefropatie
Interpretace výsledků
• Hladina IgE (IU/ml):
↑ - alergické reakce -1. typ přecitlivělosti
- parazitární infekce
- autoimunity, imunodeficiencie
• Vyšetření komplementového systému (sérová hladina C3 a C4 (g/l), C1-INH)
↑ - zánětlivá aktivita (proteiny akutní fáze)
↓ - vrozená / získaná porucha tvorby (jaterní selhání; zvýšená spotřeba- tvorba
imunokomplexov; hereditární angioedém)
Interpretace výsledků
• Proteiny akutní fáze
↑ - akutní zánětlivá reakce = opsonizační a prozánětlivý efekt
- regulační funkce; přenašeče iontů; hemokoagulace
CRP (mg/l)
↑ - bakteriální infekce
- infarkt myokardu, pooperační období
- revmatické choroby
Komplement
• produkované jaterními buňkami, makrofágy, ...
9 základných zložiek: C1-C9
Regulátory
- pozitívní: properdin (faktor P)
- negatívní (inhibitory):
C1 INH, CR1, MCP, DAF, faktor H, faktor I, CD59, C4bp
Aktivace
komplementu
Zdroj: Aleshin et al. JBC 287 p10210.
membranolytický komplex
(MAC)
klasická cesta
patogen + Ig / CRP
C1q,r,s
lektinová cesta
patogen + MBL
MASP 1, 2
alternatívní cesta
patogen + C3b
C3 konvertáza = C2a+C4b / C3b+Bb
C3 C3b
C5 C5b
C5b
C6, C7, C8
poly C9
C2, C4 C2, C4
C5 konvertáza = C2a+C4b+C3b / C3b+Bb+C3b
Funkcie komplementu
• Lýza buněk, mikroorganizmů
(MAC)
• Opsonizace – označení cizích
buněk a částic, podpora
fagocytózy (C3b)
• Chemotaxe – přivolání dalších
složek imunitního systému
(C3a,C5a)
• Propagace imunitní reakce –
prozánětlivá aktivita (C3a,C5a)
• Immune clearance –
odstraňování imunokomplexů z
cirkulace (C3b, C4b)
Deficity komplementového systému
• C1-C4 – deficit způsobuje častější výskyt pneumonií, pyogénnych infekcí,
systémových imunokomplexových chorob (SLE-like)
• C3-C9 – náchylnost k pyogenním infekcím, u deficitu C9 jsou typické opakované
meningokové meningitidy
• C1 INH – Hereditární angioedém
Úkol č. 2 – analyzátor BNII
Protokol
• Hlavička
• Jméno, příjmení, UČO
• Datum
• Název cvičení
• Obsah protokolu (rozsah 1-2 strany, s obrázky/grafy max 3 strany)
• Teorie – princip stanovení, využití v praxi
• Pomůcky (pipety, zkumavky, reagencie…)
• Vlastní provedení testu
• Výsledky (fotografie, grafy), výpočty
• Interpretace výsledků, porovnání s normálním rozmezím/zdravou kontrolou