VÝPOČTY Burst test výpočty (1a) • Pro stanovení oxidačního vzplanutí je zapotřebí chemikálie dihydrorhodamin 123 • Výrobce ho dodává v 10mg balení • Látka se rozpouští v DMSO • Jak připravíte zásobní roztok o koncentraci 1mg/ml? Burst test výpočty (1a) • Pro stanovení oxidačního vzplanutí je zapotřebí chemikálie dihydrorhodamin 123 • Výrobce ho dodává v 10mg balení • Látka se rozpouští v DMSO • Jak připravíte zásobní roztok o koncentraci 1mg/ml? • Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO Počet zamrazovacích zkumavek (1b) • Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO • Zásobní roztok je třeba rozplnit do po 45 ul a zamrazit na -80°C • Kolik zamrazovacích zkumavek si musí laborant(ka) připravit a popsat? Počet ependorfek (1b) • Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO • Zásobní roztok je třeba rozplnit do po 45 ul a zamrazit na -80°C • Kolik zamrazovacích zkumavek si musí laborant(ka) připravit a popsat? • Laborant(ka) si musí připravit 222 zamrazovacích zkumavek Koncentrace (1c) • Pro vlastní stanovení se používá 45ul zamrazeného roztoku dihydrorhodaminu 123 (DHR123), ke kterému se přidá 455ul roztoku PBS. • Z tohoto zásobního pracovního roztoku se dává do 1 zkumavky 30ul. • Kolik DHR 123 je v jedné zkumavce? Koncentrace (1c) • Pro vlastní stanovení se používá 45ul zamrazeného roztoku dihydrorhodaminu 123 (DHR123), ke kterému se přidá 455ul roztoku PBS. • Z tohoto zásobního pracovního roztoku se dává do 1 zkumavky 30ul. • Kolik DHR 123 je v jedné zkumavce? • V jedné zkumavce je 2,7ug DHR123. Čas (1d) • Na jeden Burst test pro jednoho pacienta je zapotřebí 4 zkumavky • 45ug DHR123 se naředí na 500ul • Do každé zkumavky se přidává 30ul naředěného DHR • Za rok se testem na Burst test vyšetří průměrně 160 pacientů. • Na jak dlouho vydrží zásoba DHR123 v mrazáku – 222 zkumavek? Čas (1d) • Na jeden Burst test pro jednoho pacienta je zapotřebí 4 zkumavky • 45ug DHR123 se naředí na 500ul • Do každé zkumavky se přidává 30ul naředěného DHR • Za rok se testem na Burst test vyšetří průměrně 160 pacientů. • Na jak dlouho vydrží zásoba DHR123 v mrazáku – 222 zkumavek? • Zásoba zkumavek vydrží na 5,78 roku. Výpočty (1d) • 10mg = 10 000ug • Koncentraci 1000ug/ml získáme přídavkem 10ml DMSO. • 10ml = 10 000ul/45ul=222,22 • 1000ul…..1000ug DHR 123 • 45ul……….45ug DHR123 a ty dáme do 500ul • ve 30ul pak je 30x45/500=2,7ugDHR v jedné zkumavce • Jeden pacient 4x30ul=120ul • Zásobní roztok 500ul/120=4,1 • 160 pacientů za rok: 160/4=40 – na rok budu potřebovat 40 zkumavek • Mám zásobu 222 zkumavek /40zkumavek potřebuji na rok tj. zásobu mám na 5,7 roku Příprava buněčné suspenze pro proliferaci (2a) • Pro test proliferace lymfocytů bylo zapotřebí izolovat PBMC z plné krve • Při izolaci bylo získáno 10x10*6 PBMC, přičemž bylo živých 95% izolovaných buněk. Buněčná suspenze byla v 1ml média. • Buňky budou stimulovány 5 různými stimulancii, dále bude zapotřebí ještě nestimulovaná kontrola. Pro každou stimulaci se použijí tři jamky, tj bude se pracovat v tripletech + 2 jamky jako rezerva • Na jednu jamku připadne 200 000 buněk a ty budou ve 200ul média. • Z buněčné suspenze připravte potřebné množství pracovního roztoku s buňkami, tak aby jeho koncentrace byla 1milion na ml. • Poznámka – médium je velice drahé a je třeba s ním šetřit! Výpočty (2b) • 100%.........10,0x10*6 • 95%.........=10,0x10*6 x 95/100 = 9,5x10*6 • 5 stim + 1 nestim, na každou 3 jamky =6x3=18 + 2 jamky navíc - budu potřebovat 20 jamek po 200 000bb., tj 20x200 000= 4 000 000bb = 4x10*6 . • 9,5x10*6 ………..1000ul • 4x10*6………….=4x1000/9,5 = 421ul • Ideální je připravit si roztok o koncentraci 1mil/ml • Tj k 421ul přidáme 3579 ul roztoku média, poté pipetujeme 200ul/jamka Příprava roztoku anti-CD28 (3a) • Anti-CD28 se používá jako kostimulační protilátka při stimulacích T-lymfocytů • Pro stanovení produkce IFN-γ, budeme stimulovat 10 pacientů a 10 kontrol, pro každou osobu budeme potřebovat 2 jamky po 200 000 buňkách ve 200ul média • Pro stimulaci použijte koncentraci 2ug/ml • Zásobní roztok má koncentraci 1mg/ml • Jak budete postupovat při přípravě pracovního roztoku? (jamka obsahuje 195ul média s buňkami, do 200ul doplníme 5ul přidaného stimulancia) Výpočty (3a) • 10 pac + 10 kontrol=20, každý 2 jamky, tj celkem 40jamek, v každé je 200ul • Koncentrace anti-CD28: 1mg/ml, tj. • 1000ug/1000ul • Požadovaná koncentrace je 2ug/ 1000ul, tj do 200ul potřebuji 0,4ug • Příprava zásobního roztoku: 40jamek*0,4 = 16ul zásobního roztoku anti-CD28 • Ideální je pipetovat např. 5ul na jamku, tj. potřebuji celkem 5x 40jamek= 200ul Pracovní roztok si tedy připravím: 16ul zásobního roztoku anti-CD28 + 184ul média = 200ul Ředění – kalibrační řady • Dvojková/geometrická řada • Ředění 1:1 – Neředěný vzorek – Nebo 1 + 1 ? Ředění kalibrátoru pro tvorbu kalibrační křivky v testu ELISA (4a) • Set na stanovení IL-8 obsahuje 60ul základního standardu o koncentraci 20ng/ml. Kalibrátor je určen pro dvě desky • Popište přípravu celkem 7 kalibrátorů získaných dvojkovým ředěním (geometrická řada), spotřeba každého kalibrátoru do reakce bude 200 μl - pipetuje se 100ul kalibrátoru na jamku, jamky jsou v dubletech) počítejte tak, abyste měli v každé zkumavce minimálně 200ul + 50 μl rezervní objem) • Jak provedete první ředění daného kalibrátoru abyste získali koncentraci 1000pg/ml? • Jak budete ředit dále? • Jakou koncentraci bude mít každý ze 7 připravených kalibrátorů? Ředění kalibrátoru pro tvorbu kalibrační křivky v testu ELISA (4b) • Set na stanovení IL-8 obsahuje 60ul základního standardu o koncentraci 20ng/ml. Kalibrátor je určen pro dvě desky • Popište přípravu kalibrátorů dvojkovým ředěním (geometrická řada), spotřeba každého kalibrátoru do reakce bude 200 μl - pipetuje se 100ul kalibrátoru na jamku,j amky jsou v dubletech) počítejte tak, abyste měli v každé zkumavce minimálně 200 +50 μl rezervní objem) • Jak provedete první ředění daného kalibrátoru abyste získali koncentraci 1000pg/ml? Ze základního roztoku budeme pipetovat 25ul a dám je do 475ul ředícího roztoku: Ve 25ul je 500pg (v 1000ul je 20 pg), tj pokud máme 500ug v 500ul, pak je koncentrace tohoto roztoku 1000pg/1000ul, tj. 1000pg/ml. Ředění kalibrátoru pro tvorbu kalibrační křivky v testu ELISA (4c) • Set na stanovení IL-8 obsahuje 60ul základního standardu o koncentraci 20ng/ml. Kalibrátor je určen pro dvě desky • Popište přípravu kalibrátorů dvojkovým ředěním (geometrická řada), spotřeba každého kalibrátoru do reakce bude 200 μl - pipetuje se 100ul kalibrátoru na jamku,j amky jsou v dubletech) počítejte tak, abyste měli v každé zkumavce minimálně 200 +50 μl rezervní objem) • Jak provedete první ředění daného kalibrátoru abyste získali koncentraci 1000pg/ml? Ze základního roztoku budeme pipetovat 25ul a dám je do 475ul ředícího roztoku: Ve 25ul je 500pg (v 1000ul je 20 pg), tj pokud máme 500ug v 500ul, pak je koncentrace tohoto roztoku1000pg/1000ul, tj. 1000pg/ml. • Jak budete ředit dále? Titrace vzorku pro nepřímou imunofluorescnci (5a) • Základní ředění vzorku na vyšetření ANA NIF je 1:80 (nejednoznačné vyjádření… může znamenat 1+79 nebo 1+80). Pokud jsou ANA při tomto ředění pozitivní, ordinuje odečítající většinou titraci (ředění) vzorku. • Popište, jakým způsobem byste postupovali, (jaké objemy séra a ředícího pufru byste použili), kdybyste měli naředit vzorek séra v řadě: • 1:80, 1:160 a 1:320 • 1:320, 1:640 s 1:1280 • Minimální objem séra který se bude pipetovat je 10ul • Spotřeba vzorku každé koncentrace na analýzu je 50 ul (počítejte s tím, aby byl v každé zkumavce rezervní objem 50ul navíc). Titrace vzorku pro nepřímou imunofluorscenci (5b) • Ředění 1:80: 10ul séra a 800ul ředícího pufru (PBS) • Ředění 1:160 z ředění 1:80 vzít 100ul, přidat 100ul PBS • Ředění 1:320 z ředění 1:160 vzít 100ul, přidat 100ul PBS • Ředění 1:320 přímo ze séra: 5ul séra +1600ul PBS (nebo 10ul séra + 3200ul PBS – důležité je dodržet poměr) • Následné ředění 1:640: z ředění 1:320 vzít 100ul, přidat 100ul PBS • Následné ředění 1:1280: z ředění 1:640 vzít 100ul, přidat 100ul PBS Leukocytární subpopulace • LEUKOCYTY – Granulocyty – Monocyty – Lymfocyty • B lymfocyty (CD19+) • NK buňky (CD16+CD56+) • NKT buňky (CD3+CD16+CD56+) • T lymfocyty (CD3+) » CD4 T lymfocyty (CD3+CD4+) » CD8 T lymfocyty (CD3+CD8+) Výpočet absolutního počtu lymfocytů • Při vyšetření lymfocytárních subpopulací je kromě relativního počtu ještě zapotřebí určit absolutní počet lymfocytů a jejich subpopulací, tedy reálný počet buněk, který se nachází v 1l krve. • Příklad: • Počet leukocytů v krvi pacienta: 10x10*9leukocytů/l • Z cytometrické analýzy vyplývá, že pacient má 20% lymfocytů, 10% monocytů. Kolik procent tvoří granulocyty? Jaký je absolutní počet všech lymfocytů? • Lymfocyty pacienta tvoří 60% T-lymfocytů, 30% B-lymfocytů a 10% NK buněk. ? Jaký je absolutní počet všech T-lymfocytů? • T-lymfocyty pacienta zahrnují 60% pomocných CD4+ T-lymfocytů a 40% cytotoxických CD8+ T-lymfocytů. Jaký je absolutní počet všech cytotoxických T-lymfocytů? Výpočty • 10x10*9leukocytů/l • Z cytometrické analýzy vyplývá, že pacient má 20% lymfocytů, 10% monocytů. Kolik procent tvoří granulocyty? 100-(20+10)=70 Granulocyty tvoří 70% ze všech leukocytů. • Jaký je absolutní počet všech lymfocytů? • 100%...... 10x10*9/l • 20%......2x10*9 /l Absolutní počet všech lymfocytů je 2x10*9 /l. • Lymfocyty pacienta tvoří 60% T-lymfocytů, 30% B-lymfocytů a 10% NK buněk. ? Jaký je absolutní počet všech T-lymfocytů? • 100%...... 2x10*9 /l • 60%......1,2x10*9 /l Absolutní počet všech T-lymfocytů je 1,2x10*9 /l. • T-lymfocyty pacienta zahrnují 60% pomocných CD4+ T-lymfocytů a 40% cytotoxických CD8+ T-lymfocytů. Jaký je absolutní počet všech cytotoxických T-lymfocytů? • 100%......1,2x10*9 /l • 40%......4,8x10*8 /l Absolutní počet všech lymfocytů je 4,8x10*8 /l.