Průtoková cytometrie
a stanovení lymfocytárních subpopulcí
Jana Nechvátalová
Ústav klinické imunologie a alergologie
FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
Rozdělení imunologických laboratorních metod
serologické (humorální)- detekce antigenů a protilátek,
průkaz tvorby protilátek proti infekčním agens
buněčné- stanovení počtu (relativního, absolutního) a funkčnosti
jednotlivých typů leukocytů
- odběr nesrážlivé krve do EDTA, heparinu, citrátu sodného
Cluster Designation
(Cluster of Differentiation)
• buňky exprimují ( vystavují) na svém povrchu různé specifické
molekuly – znaky, které můžeme uspořádat do skupin charakterizujících
buněčnou linii, stav diferenciace jednotlivé buňky
a její aktivace
• CD klasifikace: znak definované struktury rozpoznatelný monoklonální
protilátkou je zařazen do skupiny diferenciačních CD znaků a označen
číslem (CD1, CD2, CD3,…). V současné době je na lidských leukocytech
charakterizováno asi 400 znaků.
• Využití: CD znaky jsou používány k označení plně definovaných molekul.
Molekuly zařazené do CD klasifikace jsou členěny podle funkce.
Rozlišení adhezních membránových molekul, receptory pro rozmanité
cytokiny, molekuly vyjádřené na T lymfocytech, B lymfocytech ,
trombocytech či jiných buněčných populacích.
Blausen.com staff (2014). "Medical gallery of Blausen Medical 2014". WikiJournal of
Medicine 1 (2). DOI:10.15347/wjm/2014.010. ISSN 2002-4436.
Leukocyty: počet leukocytov v krvi – 4-9x109/l
Granulocyty
T-lymfocyty (Th CD4+; Tc CD8+)
B-Lymfocyty
NK bunky
Imunofenotypizace
buněk
• stanovení leukocytárních subpopulací pomocí
průtokové cytometrie (FACS- fluorescentactivated
cell sorting)
• odběr krve do zkumavky s EDTA
T lymfocyty
CD3 - povrchová molekula přítomná na všech T-lymfocytech
Fyziologické zastoupení v periferní krvi: 58-85 % z lymfocytů
http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/GeneralBiology/Immunology/Re
cognition/Tcell/Tcellcomplex/Tcellcomplex.htm
CD4+
TH (TH1, TH2)
pomocné
T-lymfocyty
(T helper cells)
T- lymfocyty
CD8+
TC
cytotoxické
T-lymfocyty
(cytotoxic T-cells)
fyziologické zastoupení z celkových lymfocytů
30-60 % 15-35 %
Stavba T- bunečného receptoru TCR a umístění
koreceptorových molekul CD3, CD4, CD8
zapojených do signalizace přes T-bunečný
receptor TCR.
CD19
B lymfocyty
CD19, CD20 - povrchové molekuly využívané k detekci
B lymfocytů v průtokové cytometrii
Vhodně zvolená kombinace dalších CD znaků slouží k
charakterizaci jednotlivých vývojových stadií a funkčních
subpopulací
(Warnatz K, Schlesier M 2008) Fyziologické zastoupení v periferní krvi: 7-23 % z lymfocytov
Exprese CD znaků na povrchu B lymfocytů během
jejich vývoje v kostní dřeni, sekundárních
lymfatických orgánech a periferní krvi
CD19 součástí B-bunečného receptoru BCR
NK (Natural Killer) bunky
CD16+CD56+CD3- - charakteristické povrchové markery
Fyziologické zastoupení v periferní krvi: 6-20 % z lymfocytů
- rozeznávají buňky, které mají na povrchu abnormálně málo MHC I - nádorové a virově
infikované buňky
- používají cytotoxické mechanismy
(perforin, granzymy)
Pozor!!!
NKT bunky: CD16+CD56+ CD3+
Monocyty
CD14 - povrchová molekula charakteristická pro monocyty
Fyziologické zastoupení v periferní krvi: 0-10 % z leukocytů
- součást nespecifické imunity
- schopnost fagocytózy
- tkaňová forma = makrofág
Na svém povrchu exprimují HLA DR
(Human Leukocyte Antigen DR isotype)
- navázání peptidů z pohlcených patogenů →
→ rozpoznání pomocnými T-lymfocyty
- APC = antigen prezentující buňka
CD14 jako koreceptor TLR4
- rozpoznání bakteriálních
lipopolysacharidů (LPS)
Příprava vzorku na FACS
Y
YYY
Y
Y
Y YY
YY
YY Y
Y
Y
Protřepat
(vortexovat)
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
30min.
inkubace
tma
lab. teplota
Y
Y
Y
Y
Y
Vzorek krve 45µl
Pipetovat MIX potřebných MPL
Vzorek krve 45µl + MPL
Volné MPL - vazba na receptory Plná krev značená MPL
Erytrocyt
Lymfocyt
Trombocyt
Lýza erytrocytů
• Erytrocyty přítomné ve vzorku zahlcují cytometr
proto po značení plné krve MPL je nutné erytrocyty
lyzovat
• Ke vzorku se postupně přidává:
➢ Roztok A: 600ul
➢ Příprava roztoku A: 1,5 l destilované vody + 1,8 ml 99% kyselina
mravenčí – způsobuje lýzu erytrocyů v kyselém prostředí
➢ Roztok B: 300ul
➢ Příprava roztoku B: 1,5 l destilované vody + 9,0 g bezvodého
Na2CO3, 21,75 g NaCl, 46,95 g bezvodého Na2SO4 – alkalický
roztok = zastavení lýzy a úprava pH
➢ Roztok C: 100ul
➢ Příprava roztoku C.: 1,5 l PBS (pH 7-7,4) + 15 g
paraformaldehydu – fixace buněk
Vzorky se do začátku měřaní uchovávají ve tmě při
4°C
Automatický lyzátor TQ-prep od firmy
Beckman Coulter používaný na lýzu
erytrocytů
Průtoková cytomerie je technologie umožňující současně měření a
analýzu několika fyzikálních a chemických vlastností jednotlivých
částic, které jsou unášeny v proudu kapaliny a prochází paprskem
světla.
• možnosti analýzy mnoha vlastností a charakteristik na úrovni jedné buňky
během krátkého časového úseku
• měření současně více než 20 markerů na jedné buňce
• určování fenotypu buněk,
monitorování odpovědi na léčbu,
výzkum signalizačních drah
• klíčovým nástrojem pro výzkum
poruch krvetvorby
flow+cyto+metrie - „měření buněk v pohybu“
Využití
▪ Klinické využití (imunofenotypizace a měření funkčních
vlastností buněk)
▪ Buněčná biologie (DNA, RNA analýza)
▪ Mikrobiologie (rezistence na antibiotika, kintetika)
Co měříme:
• Lomené a odražené světlo - při průchodu buněk laserovým paprskem
dochází k jeho lomu a odrazu na bunečném povrchu a buněčných organelách
• Emitovanú fluorescenciu – pokud použijeme MPL konjugované s
fluorochromem
• částice velikosti 0,2-150 µm
- prokaryotické a eukaryotické buňky
- virové částice, bakterie, houby
- komplexy Ag-Ab
Laser
MPL konjugovaná
s fluorochromem
Buňka
Emitovaná fluorescence
Lomené a odražené světlo
Princip průtokové cytometrie
Při průchodu částic laserovým paprskem dochází
k rozptylu světla a k fluorescenci navázaných fluorochromů
Světelné signály jsou převedeny na elektrické pomocí
detektorů (fotonásobiče)
Na každé buňce je možné změřit
několik parametrů zároveň
Naměřená data se ukládají
a dále analyzují
Cytometr je tvořen
třemi hlavními systémy
Fluidní systém
transport částic k laserovému paprsku
Elektronický systém
převod detekovaných
světelných signálů na signály
elektronické, vyhodnocované
počítačem
Optický systém
laser, zrcadla,
optické filtry
Fluidika
- zajišťuje transport bb. v nosné tekutině (pod tlakem) do
průtokové komory
- buňky se pohybují jedna za druhou
Řez průtokovou komorou:
uprostřed vzorek (bunečná suspenze)
unášaná nosnou kvapalinou (sheath
fluid)
Hydrodynamická fokusace
Vzorek Vzorek
Nízky tlak vzorku
Úzký proud vzorku
Menší průtok buněk
Přesnější měření
vhodné např. pro DNA
analýzu a měření funkčních
vlastností
Vysoký tlak vzorku
Široký proud vzorku
Sbírání velkého počtu částic
vhodné např. na imunofenotypizaci
buněk
Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013
- jev, který zabezpečuje uspořádání buněk jednotlivě za sebou
- rozdíl v tlaku a rychlosti nosné tekutiny a suspenze částic
- vzorek, např. bunečná suspenze je vstříknut doprostřed tzv. sheath fluid (nosná kapalina)
- nosná kapalina postupně strháva jednotlivé buňky a uspořádává je do řady za sebou
- tlak nosnej kapaliny je nastavený výrobcem, měnit můžeme tlak vzorku (nastavení rychlosti průtoku buněk)
Optika
• Excitační optika
laser a systém čoček, které
zaostřují a směřují laserový
paprsek – před ozářením
částic
• Sběrná optika
soustava čoček, která vede
a rozděluje světlo do
různých vlnových délek na
příslušné detektory –
odražené a fluorescenční
záření po ozáření částic
Excitační
optika
Sběrná optika
Band pass filtre
Dichroické zrcadla
Long pass filtre (LP)
Lasery – zdroj záření
- každý cytometr obsahuje jako zdroj záření laser
- dnes: najčasteji využívané 3 až 4 lasery v cytometru
- každý laser má charakteristickou vlnovou délku
záření → excitace různých fluorochromů
Emisní peak: při ozáření fluorochromu paprskem laseru
je emitované záření určité vlnové délky. Podle najvyšší
intenzity vlnové délky emitovaného záření se volí
vhodný detektor pro daný fluorochrom.
• ve vícebervné průtokové cytometrii dochází k emisi několika
fluorochromů najednou – tj. je emitované záření různých vlnových
délek a je nutné takto vzniklé záření rozdělit tak, aby bylo jasné, co
vyzařují jednotlivé fluorochromy
• při výběru fluorochromů se v průtokové cytometrii postupuje tak, aby
se píky emisních spekter nepřekrývali
Sběr optického signálu v průtokové cytometrii
Elektronika
• Světelné signály jsou převáděny na elektrické
• Typy detektorů:
- lavinové fotodiódy: detekce FSC
- fotonásobiče PMT (PhotoMultiplierTube): detekce SSC a fluorescence
PMT
- velmi citlivé, jsou schopné zachytit i slabé signály
- zvyšují signál primárního dopadajícího záření
Princíp PMT
Záření ve formě fotonů dopadá na fotokatodu. Z ní jsou
na základě fotoelektrického jevu vyraženy eletrony,
které jsou dále usměrněné na tzv. dynody (katody z
pozitivním napětím). Na jednotlivé dynody je privádděné
stále vyšší napětí, což umožňuje urychlení elektronů a
zvýšení jejich energie. Urychlené elektrony mají
dostatek energie na vyražení dalších elektronů z
povrchu dynod. Počet elektronů exponenciálně roste.
Vyražené elektrony dopadají nakonec na anodu, na které
dochází ke vzniku napěťového pulzu. PMT umožňuje
přeměnit slabý počátečný signál na silný napěťový pulz.
Vznik napěťového pulzu / Intenzita fluorescence
- přechod buňky laserovým paprskem generuje vznik napěťového pulzu na
detektoru
- velikost napěťového pulzu je daná intenzitou záření (intenzitou fluorescence),
které dopadlo na PMT
- intenzita fluorescence závisí na:
• expresi jednotlivých povrchových znaků
• počtu navázaných fluorochromů
• na síle fluorochromu (fluorochromy nevykazují stejnou intenzitu
fluorescence)
- napěťovým pulzům jsou pomocí
převodníků přidělené digitální hodnoty
rozdělené do 0-1024 kanálů na základě
velikosti pulzu
- každý z těchto kanálů odpovídá určité
intenzitě fluorescence
Velikost vs. granularita
• Velikost a členitost buňky určujeme na základě rozptylu záření (light scatter): procházející částice vychýlí
dopadající záření
Forward Scatter (FSC) – rozptyl záření v přímém směru → závisí na velikosti buněk = určuje velikost
Side Scatter (SSC) – rozptyl záření do stran → závisí na členitosti buněk = určuje granularitu
• Stačí jeden laser
• Není to fluorescenční záření (nepotřebujeme MPL s fluorochromi)
Fluorescence
Mnoho buněk má stejnou anebo podobnou morfologii- na základě exprese povrchových znaků je
můžeme rozdělit do skupin:
- využívají se k tomu monoklonální Ab značené fluorochromomy specifické k určitému epitopu
- fluorochrom je molekula schopná absorbovat záření specifické vlnové délky (excitace) a
následně vyzářit kvantum energie (emise) vo formě fluorescenčního záření
- částečná ztráta energie (přeměna na teplo) = Stokesův posun
Fluorochrom
- charakteristické excitační a
emisní spektrum
- Stokesov posun je daný
strukturou molekuly
FSC vs. SSC
Lymfocyty
Granulocyty
Monocyty
RBC, debris,
mrtvé buňky
veľkosť
FSC
SSC
granularita
Kombináciou FSC a SSC získavame rozlíšenie
základných subpopulácií Leukocytov
Veľkosť: lymfocyty < monocyty < granulocyty
Granularita: lymfocyty < monocyty ≤ granulocyty
Volíme 2 libovolné parametry vůči
sobě (osa x a y)
Volíme 1 vybraný parametr (osa x), na ose
y je vždy parametr count (= počet buněk)
Diferenciální rozpočet
Stanovení relativního počtu leukocytárních a lymfocytárních
subpopulací pomocí průtokové cytometrie
SSC
SSC
CD45 FITC CD45 FITC
CD45- panleukocytární znak, přítomný na všech leukocytech
x+y+z = 100 % = Leukocyty
x % Lymfocyty + y % Monocyty + z % Granulocyty
x1 % T-lym. + x2 % B-lym + x3 % NK bunky
x1+x2+x3 = 100 % = Lymfocyty
x11 % CD4 Th + x12 % CD8 Tc
x11 + x12 = 100 % = T-lymfocyty
DOT PLOT
Intenzita fluorescencie
Intenzita
fluorescencie
- každá bodka (tečka) zobrazuje 1 bunku a
vyjadruje expresiu daného znaku na bunke
- príklad grafu: Dot Plot rozdelený do 4
kvadrantov, na základe expresie
sledovaných znakov:
1. CD19+ CD3- = B-lymfocyty
(11,40% z Lymfocytov)
2. CD19+ CD3+
3. CD19- CD3+ = T-lymfocyty
(83,91% z Lymfocytov)
4. CD19- CD3-
v jednotlivých kvadrantoch sa nachádzajú
bunky s podobnou expresiou znakov
1. 2.
3.4.
B-lymfocyty
T-lymfocyty
CD3- CD3+
CD19+
CD19-
MPL
Fluorochrom
Percento buniek v jednotlivom kvadrante
CD3+
CD3-
Počet
buněk
Intenzita fluorescence
MFI CD3MFI
CD3+
HISTOGRAM
Percento CD3+ buněk
Fluorochromy
• jsou excitované vhodnou vlnovou délkou (nutné zvolit správny laser)
• emitují světlo specifické vlnové délky (nutné zvolit detektor ve správném pásmu vlnových
délek)
• i neznačené bunky mohou být fluorescenční kvůli slabé autofluorescenci
• Polycyklické organické molekuly a jejich deriváty
- Fluorescein isothiokyanát (FITC), Cyaniny, Texas Red, rada Alexa,
Pacific a Cascade
- AmCyan, Propidium Iodide, 7-AAD, CFSE
• Fluorescenční proteiny
- Phycoerythríny (PE), Allophycocyaniny, PerCP, GFP,...
Schopné absorbovat fotony budícího záření (napr. 488 nm) a následně (10-8 s) emitovat
fotony s delší vlnovou délkou (nap. 500 – 800 nm). Fluorescenční záření má tedy jinou
„barvu“.
Název gatu, z kterého se zobrazují buňky
Gatovací strategie: postupný výběr buněk
Naměřené vzorky obsahují, kromě různých typů buněk, také slepené buňky, mrtvé buňky
anebo prachové částice. Gatovací strategie slouží k odfiltrování nechtěných částic z
analýzy a k výběru cílové populace buěk na základě různé kombinace použitých znaků. V
grafu se následně ohraničí jen buňky, které nás zajímají (vytvoří se tzv. gate). Další graf už
zobrazuje jen buňky výběru (ohraničené) z předcházejícího grafu.
Analýza naměřených dat – Gating Strategy
Oddělení doubletu - slepených buněk Mtvé buňky a prachové částice
Výhody a nevýhody průtokové cytometrie
Výhody
• Velké množství analyzovaného
materiálu – velké množství dat
• Analýza trvá několik minut
• Kvalitativní + kvantitativní analýza
• Možné manipulační operace
např. třídění buněk podle vybraných
vlastností (cell sorting)
Nevýhody
• Vysoká finanční náročnost
• Sestavení experimentu, analýza a
vyhodnocení dat závislé na
zkšenostech obsluhy
• Analýza vzorků co najdříve po
odběru
• Nevidíme lokalizaci signálu na
buňce
Krevní diferenciál
Základní vyšetrení v imunologické laboratoři: stanovení zastoupení lymfocytárních
subpopulací v plné krvi
Průtokovou cytometrií se stanovuje počet buněk v jednotlivých subpopulácí lymfocytů a
porovnáva se s referenčními hodnotami.
Připravují se dvě zkumavky s nasledující kombinací monoklonálních protilátek MPL:
Zkumavka A: 45µl krve + x µl MPL CD45 FITC
CD3 PC5
CD4 RD-1
CD8 ECD
Zkumavka B: 45µl krve + x µl MPL CD45 FITC
CD3 PC5
CD19 ECD
CD16/56 RD-1
MPL + Fluorochrom
Vzorky krve s MPL se inkubují 30 min, následuje lýza erytrocytů a měření na průtokovém cytometru
Krevní diferenciál –
gatovací strategie
Zkumavka A:
CD3+ CD3+
CD3+
CD8+ CD4+
Zkumavka B:
CD19+ CD16/56+
Základem imunologického vyšetření je krevní diferenciál, určení základních lymfocytárních subpopulací.
Zdravá osoba
CD3+
CD8+CD4+ CD19+ CD16/56+
Fyziologické hodnoty:
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 82 (58-85)%
•CD3+ 4+: 57 (30-60)%
•CD3+ 8+: 19 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 11 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+: 6 (6-20)%
6,37%
Stanovení absolutního počtu lymfocytárních
subpopulací
!Počet leukocytů 3,6-10 x109l
lymfocyty 20-55 %
monocyty 0-10 %
granulocyty – neutrofily, eosinofily, bazofily 37-75 %
Příklad: relatívny počet abs. počet
Leukocyty 5 x109l Lymfocyty: 20% 1,0 x109l
CD3: 75% 0,75 x109l
CD19: 10% 0,1 x109l
CD15,56: 15% 0,15 x109l
Vyšetrenie lymfocytov periférnej krvi
ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA
LYMFOCYTECH PERIFERNÍ
KRVE (%)
CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos
signálu
58-85
CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II,
aktivace
30-60
CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I,
aktivace
15-35
CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23
CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor
adheze
6-20
HLA-DR B-lymfocyty, monocyty,
aktivované T-lymfocyty
MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na
všech B-lymfocytech),
T-lymfocyty 3-7
(na aktivovaných T-lymfocytech)
Hodnotenie nálezu jednotlivých subpopulácií
Snížení/
zvýšení
subpopulace onemocnění

CD19+, CD3+,
CD4+, CD8+
při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii)
 CD19+ u některých pacientů s CVID
 CD19+ B – buněčná leukémie
 CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi
 CD3+ T – buněčná leukémie
 CD4+
u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable
immunodeficiency)
- virové infekce (EBV, CMV, HIV)
 CD4+ autoimunity, alergie
 CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systémový lupus erythematodes-SLE)
 CD8+
u některých pacientů s CVID
- virové infekce (EBV, CMV, HIV)
Příklady využití FACS v praxi
Vliv infekce
Bakteriální infekce
• Počet leukocytů:  Th: CD3+ 4+: 
• Lymfocyty:  Monocyty: CD14+HLA DR+ : 
• Granulocyty: 
Virová infekce
• Počet leukocytů:  Tc: CD3+ 8+: 
• Lymfocyty:  CD3+8+HLA DR+ : 
• Granulocyty:  CD3+8+38+ : 
Pacientka: Ž,
*1957
- v krevním diferenciálu chybí B-lymfocyty (0,0 %
z celkových lymfocytů)
- v nemocničním systému zjištěná léčba
rituximabem – pacientka revmatologie
- výsledok: deplecia B lymfocytů vlivem léčby (po
4-6 měsících návrat k normálním hodnotám)
Pacient: M,
*1966
- v krevním diferenciálu vysoké B-lymfocyty
(95,50 % z celkových lymfocytů)
- Prvo-záchyt: bez historie v nemocničním
systému
- výsledek: podezření na leukémii
- nutné doplnit vyšetrení CD5+CD19+ buněk
Doplnění vyšetření na přítomnost
CD5+CD19+ buněk
CD5+CD19+ : 94.8%
- CD5+CD19+ buňky = marker chronické lymfoproliferativní choroby
- u zdravé osoby se znak CD5 vyskytuje na T-lymfocytech, normální hodnoty CD5+ na B-lymfocytech u
zdravého dospělého človeka: do 10% ze všech B-lymfocytů
Pacient: M, *1966
Výsledek: vysoký počet CD5+CD19+ = doporučaní
na hematoonkologické vyšetření
Vzorek: periferní krev odebraná do EDTA
Značení MPL:
CD45 KO - panleukocytární znak
CD19 PC7- B-lymfocyty
CD5 FITC
Pacient: M, *1999
- v krevním diferenciálu zjištěný obrácený poměr
CD3+CD4+ k CD3+CD8+ (13,2 : 50,9)
- Fyziologické hodnoty: poměr CD3+CD4+ > CD3+CD8+
- Prvo-záchyt: bez histórie v nemocničním systému
- výsledek: podozření na virovou infekci (často EBV,
CMV)
- nutné doplnit vyšetření CD8+CD38+ buněk
Pacient: M, *1999
Fyziologický obraz
Nastavení polohy gatů je
fixní- nastavené podle
zdravých kontrol
CD8+CD38+ 83,2%
CD8++CD38++ 92,2%
Doplnění vyšetření na
přítomnost zvýšené
exprese znaku CD38 na
CD3+CD8+ T-lymfocytech
- CD8+CD38+ buňky = marker virových infekcí
- u zdravé osoby je zastoupení CD8+CD38+ T- buněk nízke, u virových infekcí se zvyšuje, patologické
hodnoty = ???
- hodnoty vyšší než 50% CD8+CD38+ T-buněk z celkových CD3+CD8+ T-buněk nutné výsleděk hlásit
ošetřujícímu lékaři
Výsledek: vysoký počet CD8+CD38+ T-lymfocytů
= možná např. EBV infekce (mononukleoza),
doporučeno mikrobiologické vyšetření
SCID - Severe Combined Immunodeficiency
Těžký kombinovaný imunodeficiencit
• Primární imunodeficience (vrozená), postižena je buněčná složka imunity
• Jedná o nejzávažnější vrozenou imunodeficienci (záhy po narození těžké infekce)
• Bez léčby (transplantace kostní dřeně) úmrtí v prvním roce života (vyvíjí se také genová terapie)
• Klinické projevy:
• Infekce způsobené atypickými patogeny (pneumocysty, kandidózy, atypické mykobakteriózy, cytomegalová
pneumotitida)
• Chronické průjmy (bez průkazu etiologického agens), neprospívání, kožní infekce, komplikace po vakcinaci BCG
• Molekulární podstata je heterogenní, rozlišuje se několik skupin SCID:
1. Porucha ADA (adenosindeaminázy): Dysfunkce nebo absence tohoto enzymu způsobuje akumulaci produktů metabolismu purinů,
které jsou pro časné thymocyty toxické - rozvíjí se těžká T lymfopenie
2. SCID T-B-NK+: Absence T i B lymfocytů, NK buňky zachovány. Molekulární podstata heterogenní (některé případy deficit
rekombinázy RAG-2, porucha exprese receptoru pro IL-7)
3. SCID T-B+NK-: Chybí T lymfocyty a NK buňky, B lymfocyty zachovány. Nejčastější forma SCID (60% všech případů). 70%
případů vázáno na chromosom X – mutace genu pro gama řetězec receptoru pro IL-2. Tento gama řetězec je ale společný i
receptorům pro IL-4, IL-7, IL-9
pro IL-4, 7, 9 a 15 - funkční porucha mnoha cytokinů.
4. Retikulární dysgeneze: Postižení kmenové buňky, blokován vývoj myeloidní i lymfoidní linie.
SCID
Severe Combined Immunodeficiency – Těžký kombinovaný imunodeficit
Příklad pacienta se SCID
- záchyt u novorozenců a dětí
- nízký absolutní počet leukocytů a lymfocytů, v podstatě chybí CD3+ T-lymfocyty, počet Blymfocytů
a NK buněk může být taktéž snížený
Leukocyty: 5,0x10*9/l
Lymfocyty: 4,0x10*9/l
Nízký počet leukocytů i lymfocytů vzhledem k věku pacienta
SCID
Leu: 5,0x109/l
Ly: 4,0x109/l
T LYMFOCYTY
• CD3+: 14 (58-85)%
• CD3+4+: 8 (30-60)%
• CD3+8+: 2 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+: 71 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
• CD16,56+: 13 (6-20)%
8% 2%
71% 13%
14% 14%
Výsledok: T-B+NK+ SCID
- všechny T-lymfocyty byly mateřské, aktivované, rozpoznávají HLA antigeny kojence jako „cizí“
- možné doplnit funkční test proliferace T-lymfocytů; dítě je směřované k transplantaci kostní dřeně
HLA-B27
negativní pozitivní
Znak HLA-B27 je asociovaný s řadou zánětlivých onemocnění jako zánět kloubů, vnitřních struktur oka
(uveitida), krátkych kostí rukou, noh a šlach, dále psoriázou, chronickými bolestmi spodní částmi zad a
spondyloarthropatiou - najznáméjší je ankylózující spondylitida (zánětlivé systémové onemocnění
páteře a kloubů – Bechtěrevova choroba)
Vzorek: periferní krev odebraná do EDTA
Značení MPL:
CD3 PE- T-lymfocyty
HLA-B27 FITC
Výsledek: cytometrické
vyšetrenie HLA-B27 je jen
screeningová metoda.
Pozitivní výsledek je třeba
konfirmovat metodou PCR
Vyšetrení HLA-B27 není doplňujícím měřením
ke krvnímu diferenciálu, je to samostatné
měření
Bronchoalveolární laváž - BAL
• diagnostické bronchoskopické vyšetrenie
• pacientovi se do bronchu (větve bronchu) pomocí fibrobronchoskopu aplikuje a následně zpět
aspiruje 150-200 ml fyziologického roztoku
• sleduje se procentuální zastoupení jednotlivých typů leukocytů
• indikuje se u zánětlivých plicních onemocnění, nádorových onemocnění, intersticiálních plicních
procesech, pneumokoniózách
- vzorek: bronchoalveolární tekutina
- zpracování:
- filtrace vzorku kvůli případnému obsahu nečistot, promytí, značení MPL:
CD45 FITC – panleukocytární znak
CD3 PC5 – T-lymfocyty
CD4 RD1 – Th- lymfocyty
CD8 ECD – Tc-lymfocyty
Pozn. Vzorek BAL nesmí obsahovat krev.
V krvi je jiné zastoupení lymfocytárních subpopulací než v BAL, v případě kontaminace BAL
krví není možné rozpoznat, které lymfocyty pocházejí z krve a které z BAL, což vede ke
zkresleným výsledkům.
Bronchoalveolární laváž - BAL
v v
- Diagnosticky důležitý je poměr CD3+CD4+ k CD3+CD8+ T-lymfocytů (= imunoregulační
index)
- Fyziologické hodnoty: poměr CD3+CD4+/CD3+CD8+ = 1,1 až 3,5
- Patologické hodnoty:
- výrazná převaha pomocných CD4+ T-lymfocytů = podozření např. na sarkoidózu,
pneumónii, nádory dýchacích cest,...
- převaha cytotoxických CD8+ T-lymfocytov = podozrenie na hypersenzitívnu
pneumonitídu,...
CD4-RD1
CD8-ECD
CD4-RD1CD8-ECD
CD8- CD4-
Využití průtokové cytometrie v alergologii
Test aktivace bazofilů (bazotest - BAT)
funkční test umožňující vyšetření aktivace bazofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro
Na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE)
CD203c Založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na
povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenem
in vitro
ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní)
- sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů
Reakce přecitlivělosti jsou podstatou alergických onemocnění.
Reakce přecitlivělosti I. typu neboli IgE mediovaná alergie - je
zprostředkovaná protilátkami IgE.
IgE se naváže na bazofily ve fázi senzibilizace.
Při dálším setkání s alergenem – alergen přemostí IgE, to vede k
aktivaci bazofilů - masivnímu uvolnění produktů degranulace
bazofilů a mastocytů zvýšená exprese CD63 a CD203c
na aktivovaných bazofilech.
Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno
Vyšetření periferní
heparinizované krve,
stimulace alergenem
při 37 °C ve vodní lázni,
zastavení reakce, lýza
erytrocytů a měření na
průtokovém cytometru
Test aktivace bazofilů – gatovací strategie
(Pacient alergický na kočku – alergen Fel)
1. Na Forward
scatteru a Side
scatteru gatovány
lymfocyty
2. Z lymfocytů
gatovány pouze IgE
pozitivní buňky -
bazofily
3. Bazofily –
sledujeme CD63
a CD203c
Negativní kontrola
Bazofily jsou CD63 neg.
Pozitivní pacient – vidíme
populaci CD63 pozitivních
bazofilů