Laboratorní vyšetření pacientů se zhoubnými nádory se zaměřením na nádorové markery Dalibor Valík, Lenka Zdražilová Dubská Maligní onemocnění •Vykazuje obvykle řadu laboratorně zjistitelných abnormalit, jež jsou svým charakterem nespecifické • •Často dochází k situaci, že tyto abnormality mohou předcházet vývoji manifestního onemocnění – někdy po dlouhou dobu Diferenciální diagnosa z laboratorního pohledu – nejvýznamnější nálezy • •anémie, trombocytopenie, •Změněné jaterní testy, např. LDH •Elektroforéza sérových bílkovin (M-spike) •Tendence k hyperkoagulaci •Zvýšená sedimentace • • Problém časné detekce rakoviny •Limitace existujících metodologií (sensitivita VERSUS specificita) • •Celulární kinetika: –106 buněk = 1 mg nádoru –10 buněk = 1 ng nádoru – • Situace, které nastávají v reálném životě častěji • •1012 buněk= i.e 1 kg tumoru (!) • •…detekce pomocí PET je slibným nástrojem za předpokladu, že tumor ochotně vychytává radiofarmakum Monitorování akutní toxicity •Cytotoxická terapie indukuje rychlý buněčný rozpad • •Tento rozpad vyúsťuje v: •hyperkalémii, hyperurikémii, hyperfosfatémii • –Může vyvolat akutní reální selhání •zvýšený kreatinin a urea snahy objevit ideální nádorový marker… •Ideální nádorový marker by měl být: – –specifický pro daný typ nádoru nebo pro malignitu obecně – –dostatečně citlivý pro časnou diagnosu pro účely screeningu – • •…tyto předpoklady nejsou bohužel u většiny nádorových markerů splněny Co jsou nádorové markery ? –enzymy: (LDH, NSE, PSA etc) –hormony: katecholaminy, hCG, ACTH –onkofetální antigeny: AFP, CEA, –„specifické“ antigeny: CA15-3, CA19-9, CA125 –hormonální receptory –genetické markery: onkogeny, tumor supresory Stručná historie • 1847: –Bence-Jones protein •precipitated protein in acidified boiled urine –(monoclonal light chain) •1896 G. Beatson, castration and breast cancer •1928 ectopic hormone syndrome (ACTH-like •1930 hCG discovered •1962 hormone receptors (ER-alpha) •1985 Knudson - a two hit hypothesis „…omiky 2007“ a tumor markery •Genomické: BRCA1,2 •Transcriptomické: různé mRNA •Proteomické: proteiny, enzymy •Metabolomické: hormony, metabolity •Celulomické: hrubé celulární aberace •(chromosomální, endoreduplikace, etc: i.e. RS buňky) mRNA protein A. Karavanov, Ciphergen Biosystems, Inc Biomarkers: one housekeeping gene + its protein product and mRNA in tissues Tumor markery: užití v klinice •Populační screening •Diferenciáloní diagnosa •Prognostické indikátory •Monitoring odpovědi na terapii •Detekce návratu choroby http://egtm.web.med.uni-muenchen.de/img/logo_klein.jpg ACBI logo ESMO European Society for Medical Oncology http://www.nacb.org/images/logo.jpg ACBI Screening N Ni N Nm N Diagnosis/ Case-finding Ni Ni N Ni Y Staging/ Prognosis Y N Y Y Y Y Detecting recurrence Y Y Y Y Y Monitoring therapy Y Y Y Y Summary of Key Guideline Recommendations for the use of CA 125 Source: Sturgeon, C. Practice Guidelines for Tumor Marker Use in the Clinic. Clinical Chemistry 48:8, 1151-1159. 2002. Y = Recommended by the organization N = Not recommended by the organization Ni = Only if CEA is increased at presentation and CA 125 is not Nm = In combination with transvaginal sonography, CA 125 may have a role in the early detection of ovarian cancer in women with a hereditary ovarian cancer syndrome. ACBI = Association of Clinical Biochemists in Ireland; AJCC = American Joint Committee on Cancer; EGTM = European Group on Tumor Markers; ESMO = European Society for Medical Oncology NACB =National Academy of Clinical Biochemistry; SOR = Standards, Options, and Recommendations Tumor markery: analytické metody •Kvantitativní imunoanalýza –dnes hlavní analytický přístup •Manuální ELISA •Určení aktivity enzymů •Určení vazebné kapacity •Chromatografické techniky a hmotnostní spektrometrie Karcinoembryonální antigen (CEA) • glykoprotein (MW 180,000D) • má 6 antigenních determinant •Je produkován během embryonálního vývoje v GIT fétu •Hladiny jsou zvýšené u kuřáků •Je zvýšen u kolorektálního karcinomu, karcinomu pankreatu, prsu, plic, žaludku •Jeho hlavní klinické využití: detekce návratu choroby a efektu terapie. Alfa-fetoprotein (AFP) •glykoprotein (MW 70,000D) •Objevuje se v žloutkovém vaku, fetálních játrech a GIT, jeho funkce je neznáma (fetální analog albuminu ?) •Peak ve fetálním séru mezi 12-16 týdnem •Používá se pro: –diagnostiku NTD and trisomie 21 –diagnosu a monitoring hepatocelulárního karcinomu –monitoring terapie germinálních tumorů (testikulárních a ovariálních nádorů) –pro screening HBs-positivní hepatitidy (2x/year) • Cancer antigen 15-3 (CA 15-3) •mucin-glykoprotein MUC1 (MW 300,000D) –využívá se zejména u karcinomu prsu •Epitopes of MUC1 denoted CA15-3 (Europe) and CA27-29 (U.S.) • •Použití zejména pro monitorování terapie a detekci návratu choroby u karcinomu prsu • •Jeho koncentrace jsou často zvýšené i u jiných pokročilých malignit (ovarium, cervix, atd.) • Cancer antigen 125 (CA 125) •Jde o diferenciační antigen z coelomového epitelu –Zejména se zvyšuje u ovariálních nádorů • •užití ve sledování efektu terapie, kde má sensitivitu až 80% při 90% specificitě) • •vyskytuje se ovšem řada falešných positivit – ascitická tekutina, jaterní poškození, cholestáza, jakýkoli proces proces v omentu (zánět, atd) • • Poorly differentiated serous ovarian cancer Hematoxylin/eosin CA125 immunostaining with presurgery serum concentration of 5404 U/ml (AxSYM) International organizations recommend the use of CA125 in management of ovarian cancer http://egtm.web.med.uni-muenchen.de/img/logo_klein.jpg ESMO European Society for Medical Oncology http://www.nacb.org/images/logo.jpg Screening N Ni N Nm N Diagnosis/Case-finding Ni Ni N Ni Y Staging/ Prognosis Y N Y Y Y Y Detecting recurrence Y Y Y Y Y Monitoring therapy Y Y Y Y Source: Sturgeon, C. Practice Guidelines for Tumor Marker Use in the Clinic. Clinical Chemistry 48:8, 1151-1159. 2002. Y = Recommended by the organization N = Not recommended by the organization Ni = Only if CEA is increased at presentation and CA 15-3 is not Nm = In combination with transvaginal sonography, CA 125 may have a role in the early detection of ovarian cancer in women with a hereditary ovarian cancer syndrome. AJCC = American Joint Committee on Cancer; EGTM = European Group on Tumor Markers; ESMO = European Society for Medical Oncology NACB =National Academy of Clinical Biochemistry; SOR = Standards, Options, and Recommendations Carbohydrate antigen 19-9 (CA 19-9) •marker volby u karcinomu pankreatu (82 % sensitivita) –pacienti s variantou krevní skupiny sialyl-Lewis a-b neprodukují CA19-9 (3-7% populace) • •Je také zvýšen u gastrointestinálních tumorů a u mucinosních ovariálních nádorů • –vylučuje se žlučí – cholestáza může tedy působit falešnou positivitu Antigen skvamosních buněk (SCC) •glykoprotein (MW.42,000D) – –kontaminace vzorku kůží nebo potem významně způsobuje falešnou positivitu –použití u skvamosního karcinomu cervixu (sensitivita 70-85%), • •small cell lung cancer (SCLC - sensitivity 30-40%), •„head and neck“ nádory (sensitivity 60%) • Cytokeratin 19 fragment (CYFRA21-1) •Cytokeratiny jsou insolubilní buněčné strukturální proteiny –tyto proteiny jsou fragmentovány během rozpadu buněk –cytokeratinové fragmenty jsou rozpustné v séru • •CYFRA 21-1 (MW 30,000D) –Je vhodný marker u „non-small-cell lung cancer“ (NSCLC) - sensitivita 40-80% v závislosti na stadiu –Je vhodným markerem u karcinomu močového měchýře invadujícího do svaloviny měchýře • Choriongonadotropin (hCG) •glykoproteinový hormon (MW 46 000D) –tvořený nekovalentně vázanými podjednotkami alfa a beta •hCG-specific antibodies are designed against beta chain –syntetizován placentárním syncitiotrofoblastem – –u germinálních nádorů je syntetizován trofoblastickými strukturami nebo nebo syncytiotrofoblastickými velkými buňkami (buňky seminomu) – –hlavní účel je detekce a monitoring gravidity Choriongonadotropin (hCG) •U netěhotných žen a mužů jej lze využít k detekci maligního onemocnění • •má 100% sensitivitu pro placentární a testikulární choriokarcinomy • •má 97% sensitivitu pro hydatiformní molu, • •48 - 86% sensitivita pro non-seminal germ cell tumory Prostate-specific antigen (PSA) •…jde pravděpodobně o nejlepší nádorový marker používaný v současnosti v klinické • •glykoprotein (MW 34,000D), produkt prostatické žlázy •je to serinová proteáza účinkující na liquidifikaci ejakulátu •je částečně vázán na alfa-1-antichymotrypsin • Prostate-specific antigen (PSA) •celkový PSA < 2.5 ng/ml pod 50 let, PSA< 5 nad 50 let –důležitý je poměr: free PSA/total PSA (u karcinomu < 0,18) •užití pro screening, diagnosu a monitoring karcinomu prostaty •falešná positivita se objevuje u prostatitis a po vyšetření per rectum • Neuron-specifická enolasa ( NSE) •Jde o variantu glykolytického enzymu enolasy •Vyskytuje se v neuroendokrinních tkáních a plicích •Je to marker volby SCLC (small cell lung cancer), jak v diagnostice, tak monitoringu •Vhodný i v pediatrické onkologii pro neuroblastom (85%sensitivita), občas je první nález diagnostický •!!! Hemolýza zvyšuje, koncentraci, tj dochází k významné falešné positivitě. Beta-2-mikroglobulin •identický s lehkým řetězcem HLA – –MW 11,800 D –Jeho nízké koncentrace jsou detegovány ve většině tělesných tekutin –Je volně filtrován glomerulární membránou a cca z 99,8 % reabsorbován proximálním tubulem –Fysiologický poločas rozpadu je cca 40 min –Hraje důležitou roli v aktivaci lymfocytů • Beta-2-mikroglobulin • •používá se pro diagnosu glomerulární a tubulární nefropathie –je ale velmi nestabilní moči • •…pro určení prognosy nehodgkinských lymfomů a mnohočetného myelomu Tkáňový polypeptidový antigen ( TPA) Tkáňový polypeptid-specifický antigen (TPS) •TPA je cytokeratinový antigen s MW 22 000 D • •tradičně je považovaný za antigen „proliferační“ • •je vhodným markerem pro tumory plic a měchýře • •zvýšené hladiny se však také nacházejí u zánětů a benigního onemocnění plic, jater a urogenitálního traktu • •TPS je specifická forma TPA charakterizovaná nepřímo protilátkou anti-M3 • Důležité webové odkazy • •www.asco.org •www.nacb.org •http://egtm.web.med.uni-muenchen.de/index2.html • Klíčové faktory ve stanovoání tumorových markerů • •statistické •biologické •metodologické statistické •Sensitivita: TP/(TP + FN) x 100 •Specificita: TN/(TN + FP) x 100 •PV+ : TP/(TP + FP) •PV- : TN(TN + FN) •ROC analýza • biologické • •…vzpomeň na nespecificitu nádorových markerů Source: http://egtm.web.med.uni-muenchen.de/index2.html *Note: Percentages in table may differ from package insert. due to study differences. “Benign diseases, menstrual cycle, and the first term of pregnancy give rise to elevated levels of CA 125” Source: http://egtm.web.med.uni-muenchen.de/index2.html *Note: Percentages in table may differ from package insert due to study differences. “Non-ovarian malignancies give rise to elevated CA 125 assay values” metodologické • •…většinou jde o různé zdroje interference • • ...rebaselining specimens • • •appropriate time interval over which all specimens should be run in parallel. Lidské heterofilní protilátky a anti-mouse protilátky… •Heterofilní protilátky: •Endogenní, reagující s nehumánními protilátkami (i.e Paul Bunnell – Forsmannův antigen z králičích ledvin) • •HAMA •Human anti-mouse antibody • –způsobují falešně positivní nebo negativní výsledky • Molekulární markery •„genetická chemopredikce“ •Prediktivní onkologie •Farmakogenetika •Detekce minimální residuální choroby (MRD) –…nově termín: „molecular remission“ • …“nové nádorové markery“ •sérový HER2/neu •U pacientek s her2/neu positivními tumory •chromogranin A •neuroendokrinní tumory •Isoenzym pyruvát kinasy, „IPK“ •seminomy, renální tumory typ Grawitz •S100/beta •maligní melanom • nové laboratorní technologie •„array“ technologie •DNA/RNA, protein, tissue • •proteomic methods •MALDI/TOF, SELDI/TOF, LC/MSMS • •laser-capture microdissection •