Materiál pro cytogenetické
vyšetření
■ periferní krev
■ vzorky různých tkání (biopsie kožní)
■ buňky plodové vody, choriových klků, placenty
■ pupečníková krev
■ buňky kostní dřeně
■ vzorky solidních nádorů
- Izolovaná DNA
- Suspenze buněk ( jádra interfázní či metafáze)
I. Metody molekulární cytogenetiky
FISH (fluorescenční in situ hybridizace)
detekce balancovaných i nebalancovaných změn
Mnohobarevná FISH – M FISH;
Spektrální karyotypování (SKY)
detekce balancovaných i nebalancovaných změn v genomu
Array-CGH - komparativní genomová
hybridizace na čipech
Agilent´s Human CGH Microarray Kit
detekce nebalancovaných změn v celém genomu
MLPA (Multiple Ligation-dependend Probe Amplification)
detekce nebalancovaných změn
FISH = fluorescenční in situ hybridizace
■ 1969 Parduová a Gall – radioaktivní značení
■ 1986 Pinkel a spol. - fluorescenční značení (FISH)
Hybridizace sondy (značené fluorescenčním barvivem) s chromozómy na
cytogenetickém preparátu
Umožňuje detekci balancovaných i nebalancovaných změn
v interfázních buňkách i v mitózách
Postup FISH
Zhotovení kvalitních preparátů
1. Denaturace sondy i cílového místa
2. Hybridizace
3. Odmytí
4. Barvení pozadí
5. Hodnocení pomocí
fluorescenčního mikroskopu
• fluorescenční mikroskop vybavený
sadou fluorescenčních filtrů
• citlivá ČB kamera
• počítač a specifické programové
moduly pro aplikace FISH, M-FISH
FISH Vybavení
FISH : Typy sond
■ Celochromozomové
■ Centromerické
■ Sondy subtelomerické
■ Sondy lokus specifické
Sondy pro jedinečné sekvence:
a) plazmidové (500pb-5 kb)
b) kosmidové (20-50 kb)
c) bakteriofág lambda (8-15 kb)
d) YAC klony (50-1000 kb)
Značení DNA sond
■ fluorochromy, Texas Red, Spectrum Green,
Spectrum Orange, FITC, TRITC
SpectrumAqua, SpectrumGold, aj
FISH : Přítomnost, počet a poloha signálů
Identifikace každého chromozómu pomocí
jedinečné kombinace 5 fluorochromů FITC,
Rhodamin, TexasRed, Cy5, Cy5.5
●referenční spektra - pseudobarvy, přiřazeny
každému chromozómovému páru na základě
měření vlnových délek
Nevýhody - potřeba kvalitních mitóz
- úspěšná hybridizace
- finančně nákladné
Umožňuje odhalení balancovaných a
nebalancovaných ( i kryptických ) přestaveb
celého genomu v jednom kroku
Mnohobarevná FISH (M FISH)
Spektrální karyotypování (SKY)
vícebarevné FISH techniky – detekce více značených sond na jednom
preparátu
Speicher a kol., 1996 (M-FISH), Schröck a kol., 1996 (SKY)
Obr. 10 (Dokumentace OLG FN Brno)
M FISH/SKY - komplexní karyotyp
Mnohobarevné pruhování (M-banding)
▪ parciální malovací sondy ze specifických
oblastí chromozomů
▪ fluorescenční signály jednotlivých sond se
podél sledovaného chromozomu částečně
překrývají a dochází k jejich kombinaci
▪ umožňuje rozlišení intrachromozomových
přestaveb (inverzí)
Komparativní genomová hybridizace
na čipech (array-CGH)
• Efektivní metoda celogenomového screeningu
nebalancovaných přestaveb chromosomů během 1 hybridizační
reakce
• Založena na společné hybridizaci různě značených vzorků DNA
(testované DNA a referenční DNA) na DNA mikročip pokrytý
fragmenty oligonukleotidů
• Ztráta či zisk genetického materiálu v testované DNA je odečten
ze spotů vykazující abnormální poměry intenzit signálů
Kdo je vhodným pacientem?
• Pacienti s intelektuálním postižením (neurovývojovými poruchami, vývojovými
poruchami intelektu), poruchami autistického spektra, vrozenými vývojovými
vadami, stigmatizací...
• Prenatální indikace z důvodu abnormálního průběhu gravidity (abnormální
prenatální screening)
• Tkáň potracených plodů
• Vzorky nádorové tkáně
● Solinas-Toldo a kol., 1997
● vyhází z principu klasické (chromosomální) CGH
● nahrazení chromozomů separovanými klony
(BAC, c-DNA klony, oligonukleotidy)
■
Array-CGHCG
H
Původ metody array-CGH
Array CGH
Materiál:
• DNA izolovaná z biologického materiálu vyšetřovaného jedince
• Prenatální – amniocyty, buňky choriových klků, lymfocyty
fetální krve, buňky z tkání potracených plodů (kůže)
• Postnatální – lymfocyty periferní krve
• Onkologický materiál – nádorové buňky (solidní nádory,
hematologické malignity)
• DNA referenční (nejčastěji komerční příprava)
• do reakce 500-1500 ng DNA dle typu platformy mikročipu
• nutná přesná kvantifikace – do reakce shodná množství DNA
reference a testované DNA
• Kontrola kvality DNA (A260/280, A260/230, integrita DNA)
Princip array-CGH
Agilent Human CGH Microarray
Oligo arrays
• 8x15K custom chip
• 4x44K 43 kb rozlišení
• 2x105K 21 kb rozlišení
• 1x244K 9 Kb rozlišení
Nové typy – Sure Print G3 Human
• 8x60K 41 Kb rozlišení
• 4x180K 13 Kb rozlišení
• 2x400K 5 Kb rozlišení
• 1x1M 2 Kb rozlišení
HRCGH
negativní
8x15K
negativní
4x44K
del(1)(p36)
2x105K
del(1)(p36)
del(1)(p36), cca 3 Mb
aCGH Analytics Software, Agilent Technologies
Array CGH : vyhodnocení
Interpretace nálezů CNVs musí probíhat vždy v
kontextu s:
1. Fenotyp jedince
2. Vyšetření rodičů -> stanovení původu CNVs (de novo/zděděná
CNV od rodiče s normálním/patologickým fenotypem)
3. Informace v databázích genetických variant (UCSC,
DECIPHER, DGV...) a o genech v oblasti CNVs (databáze
OMIM)
4. Informace v relevantní vědecké literatuře (Pubmed...)
1971 G-pruhování (5 – 10 Mb)
1986 Molekulární cytogenetika
FISH (100 kb)
1997 array-CGH (oligo 0,06 kb)
2000 NGS
Od chromozomů
…k analýzám DNA
…
Vývoj nových cytogenetických technik pro
detekci chromozomových změn
2010 Optical mapping
Děti s neurovývojovými onemocněními, ÚLGG, FN Brno
FISH, MLPA
Array-CGH
WES
> 200 dětí s NDDs / rok 2007-2022 ~1500 dětí
~ 5 %
~ 18 %
~ 40 %
% dětí s
NDDs a
stanovenou
diagnózou
~ 60 %
WES
● Vyšetřeno 68 rodin (64 trií + 4 quatra) – 72 probandů
● 30 dívek, 42 chlapců
● diagnostický záchyt 44 % (32/72) klinicky významných sekvenčních variant
(29) a CNVs (3) (patogenní nebo pravděpodobně patogenní varianty)
● delece exonu 2 v genu GRIN2A, exonů 3-5 v genu ZC4H2
● Human Core Exome kit (Twist
Biosciences) + Illumina NovaSeq 6000
● Bioinformatické zpracování dat dle
in-house pipelines
● Verifikace variant - Sangerovo
sekvenování, qPCR, MLPA
Existuje univerzální metoda, která by
nahradila vše?
II. Využití metod molekulární cytogenetiky
v klinické genetice dle typu aberací
Detekce numerických změn: aneuploidie (monozomie, trizomie,…)
Detekce strukturních změn:
- balancované: inverze, reciproké translokace,
robertson. translokace,…
- nebalancované:
-Mikrodelece (mikrodeleční/mikroduplikační syndromy, CNV,..)
-Subtelomerické přestavby
-Nebalancované translokace
-Marker chromozomy
-Izochromozom; ring chromozomy,…
Detekce LOH, UPD
Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady)
numerické změny: Downův syndrom 47,XX/XY,+21
FISH
Využití metod molekulární cytogenetiky
(příklady)
numerické změny: Klinefelterův syndrom
■ 47,XXY
■ vysoká postava, porucha
růstu vousů, ženská
distribuce podkožního
tuku, PMR
FISH
Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady)
numerické změny: Turnerův syndrom
■ 45,X
■ chybí jeden chromozom X
■ 1/2500 dívek
■ 95 % SA
■ malá postava, chybí vaječníky až
sterilita
FISH
■ výskyt v populaci s četností asi 1 : 500
■ neovlivňují jednoznačně fenotyp nositele (5 x vyšší výskyt v
populaci mentálně retardovaných pacientů)
■ významná příčina sterilit u přenašečů
■ v důsledku aberantní meiotické segregace vznik gamet s
nebalancovanými přestavbami (duplikace, delece)
■ Metoda FISH, karyotyp
Využití metod molekulární cytogenetiky
strukturní změny: balancované translokace
Mikrodeleční syndromy
• růstová retardace
• dysmorfismus
• stigmata
• mentální retardace
• malformace
• vrozené vady
Obecné příznaky:
Jsou způsobeny mikrodelecí úseku chromozomu – většinou 2 – 4 Mb
Nejčastější rekurentní mikrodeleční syndromy:
DiGeorgeův/Velokardiofaciální syndrom
Prader-Williho a Angelmanův syndrom
Williamsův-Beurenův syndrom
Využití metod molekulární cytogenetiky
FISH: detekce mikrodelečních syndromů
– např. del 22q11 DiGeorge syndrom
■ SRDEČNÍ VADY
■ ANOMÁLIE TVÁŘE
■ PORUCHY IMUNITY
Využití metod molekulární cytogenetiky
FISH: DiGeorge syndrom del 22q11
Dvoubarevná FISH
Obrázek: Ukázka normální
mitózy a mitózy
s mikrodelecí 22q11
vyšetřená pomocí techniky
FISH (de Ravel et al., 2007;
upraveno)
Obrázek: Příklad komerčně
dostupných sond pro detekci
mikrodelece 22q11
(www.cytocell.co.uk)
Využití metod molekulární cytogenetiky
MLPA: DiGeorge syndrom del 22q11.2
SALSA MLPA probemix P250-B2 DiGeorge contains 48 MLPA probes with amplification products between 129
and 487 nt: 29 probes are located in the 22q11.2 region and can be used to distinguish the most common types of
deletion. Nineteen probes are present for relevant regions of DiGeorge syndrome (DGS), DGS type II or disorders
with phenotypic features of DGS on 22q13 and on chromosomes 4q, 8p, 9q, 10p and 17p.
Array-CGH profil DNA pacienta s mikrodeleci 22q11 o velikosti 2,72 Mb
ISCN: arr[GRCh37] 22q11.21(18818376_21540347)x1
Využití metod molekulární cytogenetiky
Array CGH: DiGeorge syndrom del 22q11
Pomocí DNA čipů zjistíme i velikost mikrodelece
■ skupina geneticky podmíněných chorob, jejichž příčinou jsou
drobné mikrodelece DNA segmentů (2-4 Mb), které nejsou
detekovatelné klasickými cytogenetickými metodami
■ pacienti mají specifické klinické příznaky…dříve popis dle
fenotypu („phenotype first“…)
■ nyní přístup „genotype first“ …nejprve nález, srovnání
velikosti, genů – vliv na fenotyp
■ rekurentní - vznikají opakovaně ve stejném
místě na chromozomu …např. del 22q11
■ nerekurentní - mohou vzniknout kdekoliv v genomu …
Využití metod molekulární cytogenetiky
strukturní změny: Mikrodeleční syndromy
Využití metod molekulární cytogenetiky
mikrodeleční syndromy : Prader Willi a Angelman syndrom
del 15q11-13
Metody pro stanovení diagnózy PWS a AS
Cytogenetické : karyotyp - translokace
Molekulárně cytogenetické : FISH - mikrodelece
15q11-13 DNA sonda
MLPA, array-CGH
Molekulárně genetické:
PCR - uniparentální disomie, Metylační analýza