Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště1 Epigenetika a vliv životního prostředí Farmakogenetika Mgr. David Galuška Historie ̶ brněnský kněz a středoškolský profesor Johann Gregor Mendel se zabýval křížením různobarevných odrůd hrachu ̶ Genotypové zákony: o Zákon o samostatnosti alel Genotyp je soubor samostatných genů určujících znaky. Každý znak je určen dvojicí samostatných alel. o Zákon o segregaci alel Dvojice samostatných alel se při zrání rozcházejí a do každé gamety přechází jedna z obou alel. o Zákon o nezávislé kombinaci alel ̶ Fenotypové zákony o Zákon o uniformitě hybridů Křížíme-li dominantního homozygota s homozygotem recesivním, jsou jejich potomci F1 generace v sledovaném znaku všichni stejní. Reciproká křížení u jakýchkoliv jedinců F1 generace dávají shodné výsledky. o Zákon o štěpení v potomstvu hybridů Při křížení heterozygotů lze genotypy a fenotypy vzniklých jedinců vyjádřit poměrem malých celých čísel. Vzniká genotypový a fenotypový štěpný poměr. Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště2 3 Historie DNA • molekula DNA jako taková byla objevena v roce 1869, kdy se švýcarskému lékaři Friedrich Miescherovi podařilo vyizolovat DNA z bílých krvinek • 1962 obdrželi společně Francis Crick, James Watson a Maurice Wilkins Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství. Rosalyn Franklin se pro tragické úmrtí této ceny nedočkala. 5 Základní genetické pojmy gen, alela, genom, chromozom lokus alely - dominantní - recesivní homozygot heterozygot genotyp fenotyp Karyotyp člověka • každý biologický druh má svou charakteristickou chrom. výbavu (počet a morfologii) = karyotyp • u člověka mají somatické diploidní - 46 chromozomů • 22 párů homologních autozomů • 1 pár gonozomů (44XX nebo 44XY) • gamety (vajíčko, spermie) 23 – haploidní • standardní klasifikace číslováním podle velikosti • zpracování vzorku buněk pro karyotyp • nejlépe hodnotitelné jsou kondenzované chromozomy v metafázi nebo prometafázi mitózy • lymfocyty perif. krve nutno uvést do mitózy mitogenem a zastavit v metafázi např. colchicinem • barvením chromozomů (např. Giems) se dosáhne charakteristického pruhování a tím rozlišení jednotlivých chromozomů • hodnocení karyotypu • manuální – obarvený chromozomový “rozptyl” (nejč. mitotické lymfocyty) se po obarvení vyfotí, vystřihnou a seřadí do párů • automatizované (mikroskop + software) Mimojaderná DNA mitochondriální DNA původ: alfaproteobakterie pohlcena eukaryotickou buňkou mnoho genů během evoluce bylo z mtDNA horizontálně přeneseno do buněčného jádra (geny v jádře kódující různé mitochondriální proteiny silně připomínají bakteriální proteiny) ~ 16,5 tisíce bp kóduje 37 genů o24 genů pro různou nekódující RNA o13 genů kóduje vlastní mitochondriální polypeptidy zapojené v mitochondriálních procesech (využívány během oxidativní fosforylace) maternální dědičnost genetické analýzy: na základě mtDNA určena migrace lidstva - „mitochondriální Eva“, která žila ~ před 140 000 lety v místech dnesšní Etiopie, Keni nebo Tanzanie Genetická variabilita (~0.1%) DNA sekvence kódujících i nekódujících úseků genomu je variabilní v populaci pro daný gen vyskytuje vícero variant (= alel) s různou populační frekvencí = genetická variabilita, která je výsledkem několika procesů 1) sexuální reprodukce 2) nezávislé meiotické segregace 23 párů ch. → 223 kombinací = 8,388,608 různých gamet 3) rekombinace (meiotický crossing-over) >> kombinací než 8 miliónů 4) mutageneze de novo chyba při DNA replikaci proof-reading DNA polymerázy ani mismatch DNA repair není 100% působení externích mutagenů 5) genetický drift 6) přirozená selekce Vliv prostředí na lidský genom Genetická výbava jedince je sice osudově zadána v okamžiku zplození, ale není pro další život konečná, protože v průběhu života se může měnit jak pod vlivem četných faktorů epigenetických (vlivy prostředí), tak pod vlivem dalších faktorů genetických (např. mutacemi somatických buněk v průběhu maligní transformace). • Biologické mutageny: onkogenní viry: adenoviry, herpes viry, virus Epsteina-Barrové, Rousův sarkomální virus a Rauscherův virus leukémie • Fyzikální mutageny: záření (rentgenové, gama, UV – tvorba thymidinových dimerů) • Chemické mutageny: organické, alkylační činidla (ATB), anorganické látky, alkaloidy, kationty těžkých kovů, peroxidy, dusitany, aromatické chlorované deriváty, volné radikály (O.) Klasifikace geneticky podmíněných nemocí prakticky každá nemoc (tj. její vznik a progrese) je u daného jedince modifikována genetickou výbavou, avšak s různým podílem na finálním fenotypu snad s výjimkou úrazů, závažných intoxikací a vysoce virulentních infekcí, kde individuální genetická konstituce nehraje prakticky žádnou roli monogenní nemoci jedna kritická “chyba” (tj. alela) konkrétního genu je sama o sobě nebo v homozygotní kombinaci téměř výhradně zodpovědná za rozvoj nemoci (fenotypu) nebo přenašečství a tedy zvýšenému riziku pro potomky chromozomální poruchy nejedná se o konkrétní chybu ale o nadbytek/nedostatek genů obsažených v celých chromozomech nebo jejich segmentech (“gene dosage” efekt) komplexní (poly-, multigenní) nemoci genetická dispozice podmíněná kombinací alel několika genů je výrazně manifestována prostředím a komorbiditami Genové mutace Srpkovitá anemie missense mutace genu pro hemoglobin na 6. pozici v ß-řetězci (hydrofóbní valin místo hydrofilní glutamové kyseliny, tvorba shluků Hb a tím změna tvaru ery) → HbS autosomálně recesivní Srpkovité červené krvinky mnohem hůř přenášejí kyslík. Lidé se srpkovitou anémií mají proto ve srovnání s obyčejnými lidmi červených krvinek víc. To jim dává proti malárii velkou výhodu, díky níž mají lepší šanci přežít. ancestral mutant DNA -CTC- -CACmRNA -GAG- -GUGAA -glu- -val- Genové mutace Hemofilie A = nedostatek srážecího faktoru VIII inzerce 3000 bp – snížení tvorby proteinu gonozomálně recesivní – vazba na X chromozom žena je přenašečka Epigenetické faktory Kojení a obezita ̶ Mléko aktivuje Peroxisome proliferator-activated receptor α ̶ PPARα ̶ Ten způsobuje demetylaci genů potřebných pro β-oxidaci MK v játrech ̶ Lepší utilizace MK v průběhu života Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště14 Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště15 Intervence Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště16 Epigenetické faktory Proč nejsou dvojčata stejná? John Gurdon (1958, Filadelfie) – klonování žab -> Dolly Shinya Yamanaka (~2000) klonování myší Odstranění epigenetických značek za pomocí proteinů a RNA přítomných ve vajíčku (použil 4 geny, c-myc) Komplexní nemoci multifaktoriální, multigenní, polygenní roli hrají kombinace určitých genů a určitých faktorů zevního prostředí Na odhalení nejobecnějších principů genetiky multifaktoriálních nemocí se na rozdíl od genetiky nemocí mendelistických v současné době stále ještě čeká. v klinické praxi často kolísá názor na výsledky genetických studií, které se snaží odhalit genetický podklad komplexních nemocí, od neodůvodněného očekávání nad nalezenými geny velkého účinku až po velkou skepsi vzhledem k existenci genetického podkladu v populaci četných nemocí ( nad 1%), jako je v kardiologii např. esenciální hypertenze. pokud choroba má prokazatelně familiární výskyt, musíme očekávat podíl genetického podkladu na její manifestaci, a to i v tom případě, že není dosud dobře definován nebo dosavadní znalost nepovažujeme za přesvědčivou. Své genetické pozadí mají i tak relativně vzdálené proximální fenotypy, jako je např. kvalita života u nemocných s chronickým kardiovaskulárním onemocněním. Každá choroba má nějaké genetické pozadí, jehož podíl na manifestaci dané choroby je různý. Genetické studie Základní debata nad genetickým podkladem nemocí logicky začíná od strategie výběru tzv. kandidátních genů. Tato otázka je podstatně jednodušší u mendelisticky děděných nemocí, kde se změněná funkce jednoho genu snadněji identifikuje. Celogenomové asociační studie (GWAS=Genome-Wide Association Study) vyhledávají polymorfismus jednotlivých nukleotidů nebo běžné genové variace, které se typicky chovají jako ukazatelé genových oblastí s malým efektem u stoupajícího rizika nemocí. Dalším významným momentem je výběr statistické metodologie, která zhodnotí sílu asociace genů s chorobami. Možnosti jsou v zásadě dvě: linkage (vazebná) analýza a asociační studie. K detekci specifických genetických oblastí a genů, které se účastní v transmisi nemoci, je v principu možné použít obě metody. Farmakogenetika 20 Cíl Na základě interdisciplinárního integrace znalostí farmakologie a genetiky popsat vliv dědičnosti na odpověď organismu na různé léky. ➢Farmakogenomika ✓Farmakodynamika: popisuje žádoucí či nežádoucí účinky léků na organismus (lék→ organismus) ✓Farmakokinetika: se zabývá hladinami léků a jeho metabolitů v různých tkáních a vstřebáváním léků, jejich distribucí, metabolismem a eliminací (organismus → lék) 21 Klíčové složky farmakogenetiky Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště22 Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště23 Vztah ke genům Téměř každá dráha metabolismu léku, jeho transportu nebo aktivace je ovlivněna genetickou variabilitou. Klinická variabilita v odpovědi Riziko vedlejších účinků Genotypově specifické dávkování Polymorfní cíle léku 24 Klinický potenciál farmakogenetiky Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště25 Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště26 • Odhalení onemocnění v raném stádiu, kdy je snadnější účinně léčit; • Usnadnění výběru optimální léčby a omezit léčbu pokus-chyba; • Snížení výskytu nežádoucích účinků; • Zvýšení odpovídavosti pacienta na léčbou Výhody klinické genetiky • Zlepšení výběru cílů ve vývoji léků a snížit čas, náklady a selhání klinických zkoušek; • Důraz na prevenci; • Snížení celkových nákladů na zdravotní péči Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště27 Kolik lidských genů představuje cíle současných léků? 1) ~500 (5% celkového genomu) 2) ~1,000 (10%) 3) ~5,000 (25%) 4) ~10,000 (50%) 5) ~ 15,000 (75%) 6) ~20,000 (100%) 28 P450 CYP3A4 – 50% metabolizovaných léků CYP2D6 – 20% CYP2C9 + CYP2C19- 15 % CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 a CYP2A6 byly prokázány jako funkčně polymorfní Např. ovlivňuje metabolismus warfarinu, acenocoumarolu a dalších léků (phenotyoin, tolbutamid, glipizide a další perorální antidiabetika typu sulfonylurey). 29 Metabolizace xenobiotik Cytochrom P4502C9 (CYP2C9) • dvě alelické varianty genu CYP2C9 1, 2 • CYP2C9*2 • záměna C430T v exonu 3 vede k substituci Arg144Cys • CYP2C9*3 • záměna A1075C v exonu 7 vede k substituci Ile359Leu • in vitro má CYP2C9*1 normální, zatímco varianta CYP2C9*2 vykazuje menší a CYP2C9*3 podstatně menší enzymatickou aktivitu 3, 4 • fenotypickým projevem je snížení clearance léků závislých na CYP2C9 1. Stubbins MJ et al: Pharmacogenetics 1996; 6:429-329 3. Rettie AE et al: Pharmacogenetics 1994; 4:39-42 2. Veronese ME et al: Biochem J 1993; 289:533-8 4. Haining RL et al: Arch Biochem Biophys 1996; 333:447-5830 31 CYP2C9 ACTIVITA Prescribed Daily Warfarin Dose and CYP2C9 Genotype Warfarin Dose* Genotype 5.63 (2.56) *1/*1 4.88 (2.57) *1/*2 3.32 (0.94) *1/*3 4.07 (1.48) *2/*2 2.34 (0.35) *2/*3 1.60 (0.81) *3/*3 *Data presented as mean (SD) daily dose in mg From: Higashi MK, et al. Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy. JAMA 287:1690-1698, 2002. 32 From: Esteller M, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. NEJM 243:1350-1354, 2000. Epigenetika MGMT – methylguanine-DNA methyltransferase Metylatilace promotoru MGMT silencing genu 33 From: Esteller M, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. NEJM 243:1350-1354, 2000. Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště34 Příběhy vědy: rakovina Bi0001 Příběhy vědy: gen CORE001 https://www.ceskatelevize.cz/ porady/10441294653-hyde- park- civilizace/220411058090919/ Doporučená literatura